Когда в организм попадает какая-то подозрительная молекула (патогенный фактор), срабатывают системы защиты, основанные на врожденном и приобретенном (адаптивном) иммунитете. Когда-то, на заре иммунологии, шел яростный спор между разными научными школами о том, какой же из этих видов иммунитета играет главную роль. Благодаря очевидным практическим результатам вроде создания противодифтерийной сыворотки иммунология долгое время развивалась в русле исследований приобретенного иммунного ответа, основанного на выработке антител. И перед ней, естественно, вставал вопрос: как же образуются антитела?

За решение этой проблемы первым взялся Пауль Эрлих, про которого я уже не раз упоминал. В работе 1897 года «Измерение активности дифтерийной сыворотки и ее теоретические основы» он выдвинул гипотезу образования антител, основанную на разрабатываемой им с 1885 года теории боковых цепей. Эрлих полагал, что к поверхности ядер клеток в виде боковых цепей присоединены молекулы, отвечающие за специфические функции клетки. Определенные участки антигенов – позже их стали называть факторами специфичности или детерминантными группами – благодаря химическому сродству (аффинности) связываются с этими боковыми цепями (впоследствии Эрлих переименовал их в рецепторы), вызывая усиленную выработку их клетками. Продуцируемые в изобилии рецепторы попадают из клеток в плазму, где циркулируют в виде антител, связываясь с антигенами. Таким образом, Эрлих рассматривал взаимодействие антитело‒антиген как обычную химическую реакцию.

Теория Эрлиха была опровергнута в 1923 году Карлом Ландштейнером (да-да, тем самым), который обнаружил, что некоторые низкомолекулярные вещества, названные им гаптенами, не способны стимулировать образование антител сами по себе, но в то же время иммунный ответ можно вызвать с помощью гаптена, присоединенного к большой молекуле (обычно белковой), называемой носителем. Иммунизация комплексом гаптен‒носитель вызывает появление антител как против носителя, так и против гаптена, то есть гаптены способны связываться с такими антителами в силу аффинности, но сами по себе не вызывают образования антител.

Проблему попытались разрешить, оставаясь в рамках чисто химических представлений. Были выдвинуты так называемые матричные (инструктивные) теории, суть которых при различных вариациях сводилась к тому, что синтез антител происходит на поверхности антигенов, служащей своеобразной матрицей (по аналогии с матрицами для отливки типографского шрифта). Казус с гаптенами объяснялся тем, что для синтеза на матрице требовалась достаточно протяженная поверхность. Но эти теории не могли объяснить, почему же организм не вырабатывает антитела к собственным антигенам (толерантность) и почему при повторном контакте организма с антигеном происходит более быстрая и сильная генерация антител (иммунологическая память).

Ответ на эти вопросы дала разработанная в 1957 году усилиями датского иммунолога Нильса Ерне (1911‒1994) и австралийского вирусолога Фрэнка Бёрнета (1899‒1985) клонально-селективная теория, в каком-то смысле возродившая теорию боковых цепей Эрлиха. После ряда уточнений вкратце эта теория выглядит так. На поверхности B-лимфоцита имеются рецепторы, распознающие антиген, так что неактивированные (наивные) B-лимфоциты при встрече с антигеном и срабатывании ряда других факторов начинают размножаться (пролиферировать) и превращаться в плазматические клетки (плазмоциты), которые вырабатывают антитела, причем каждая антителообразующая клетка может синтезировать только один вид антител. Некоторые потомки исходных В-лимфоцитов трансформируются в долгоживущие В-клетки памяти, поэтому иммунная система способна хранить память о контакте с антигеном, что объясняет иммунологическую память. Толерантность же объясняется тем, что незрелые B-лимфоциты проходят обучение в костном мозге, снижающее аффинность рецепторов к собственным антигенам организма.

До 1970-х годов в иммунологии теория и практика мало соприкасались между собой. Практики создавали лечебные и диагностические сыворотки, а после того, как в 1944 году исследователь из Гарварда Эдвин Кон (1892‒1953) нашел способ выделения гамма-глобулина (по сути, химически чистых антител) из плазмы крови, начали активно использовать гамма-глобулины (иммуноглобулины) для лечения и профилактики кори, гепатита и полиомиелита. Нобелевский лауреат Судзуми Тонегава (род. 1939) саркастически описывал тогдашнюю ситуацию: «Тогда вся иммунология была – заразить животное да получить вакцину». Однако в 1970-х годах результаты теоретических исследований привели к грандиозному прорыву – появлению технологии моноклональных антител.

Моноклональные антитела – это довольно модная тема, которая в СМИ излагается обычно так: «Грубо говоря, это белковый комплекс, который связывается только с другим конкретным белковым комплексом. Представьте себе клетку в виде двери, у которой есть замок со скважиной. И моноклональное антитело – это ключ, который можно повернуть в этой скважине и, скажем, вызвать апоптоз – запрограммированную природой смерть именно этой клетки, именно с таким белком. А теперь представьте себе, что эта клетка – раковая».

Ну, во-первых, мы уже знаем, что в роли детерминантных групп антигенов, с которыми связывается антитело, могут выступать и небелковые комплексы. Во-вторых, метафора «ключ‒замок» применима для всех лекарств, нацеленных на молекулярную мишень, и уж точно для всех антител, в том числе содержащихся в сыворотках и иммуноглобулинах. Ну а в-третьих, апоптоз в общем-то не самый главный механизм уничтожения клеток-мишеней, несущих антиген: антитело, стыкуясь с антигеном, чаще всего просто маркирует его, чтобы мишень атаковали эффекторные клетки организма (это называется опсонизация). Так что «ключ» поворачивать необязательно, можно прицепить к нему «маячок» для клеток-киллеров или же «бомбу» (например, радиоактивный изотоп иттрий-90 или йод-131) – подобные «связки» называют иммуноконъюгатами. В случае раковых клеток (очень непростая цель) антителу зачастую проще «встряхнуть» T-лимфоциты, которые сами с ними расправятся. Ну и в довершение ко всему этому можно добавить, что в повседневной жизни человеку чаще всего приходится сталкиваться с моноклональными телами, используемыми в диагностических целях, в частности для определения групп крови.

Так что, когда мы говорим о моноклональных антителах, следует отдавать себе отчет, что это не какой-то чудо-принцип уничтожения враждебных клеток, а технологии производства моноклонального иммуноглобулина, обладающего высокой селективностью (избирательностью) в отношении молекулярной мишени. Для выработки антител, которые содержатся в сыворотках, требуется иммунизация животных, а для получения обычных иммуноглобулинов нужна донорская кровь. Эти препараты в силу особенностей производства содержат широкий спектр антител с различной специфичностью ко многим антигенным детерминантам.

Неудивительно, что, когда был открыт механизм выработки антител в организме, появилась идея использовать антителообразующие клетки (АОК) для производства антител к заданному детерминанту. Как мы уже знаем, клон АОК (потомство исходного В-лимфоцита, реагирующего на антиген) может продуцировать только один вид антител. К сожалению, вытащить АОК из организма и поместить в искусственную питательную среду нельзя – там они погибают. Зато клетки лимфоидной опухоли (миеломы) прекрасно живут и размножаются в пробирке.

В 1975 году Мильштейн и Келер получили гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки: для этого они иммунизировали лабораторных мышей антигеном, а когда в их крови появлялись антитела, то из мышиной селезенки готовили раствор, содержащий АОК. Добавив туда клетки миеломы (той же линии мышей), они с помощью полиэтиленгликоля частично растворяли клеточные мембраны и добивались слияния АОК с клеткой миеломы в гибридную клетку – гибридому. Используя селективную питательную среду, избавлялись от оставшихся миеломных клеток, а потом рассеивали гибридомы по лункам иммунологического планшета так, чтобы в каждой лунке оказался лишь один клон. Затем путем тестирования с использованием антигена отбирался клон нужной специфичности и вводился мышам, у которых вырастала опухоль и накапливалась асцитическая жидкость в брюшной полости – источник моноклональных антител.

Понятно, что такой метод нельзя применить к людям для выработки антител. Во-первых, иммунизация людей в большинстве случаев невозможна по этическим соображениям. Во-вторых, источником человеческих АОК может служить лишь периферическая кровь, где их содержание достаточно мало. В-третьих, в случае человеческой гибридомы возникает проблема гистосовместимости клеток миеломы и АОК, тогда как у грызунов используются АОК и клетки миеломы, полученные от одной линии животных. В-четвертых, человеческие гибридомы невозможно нарабатывать в асцитических жидкостях.

Первый препарат, созданный при помощи гибридомной технологии, – Orthoclone OKT3 (муромонаб-CD3) – вышел на рынок в 1986 году и предназначался для снижения иммунного отторжения при трансплантации органов. Свое название он получил в результате сокращения его изначального длинного названия – MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3, что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3». Однако впоследствии у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, вызванных ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом.

Следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного (или крысиного) материала в препарате.

Это стало возможным благодаря генной инженерии, когда ученые освоили методику изменения кодирующей последовательности генов в ДНК в сторону «очеловечивания» (гуманизации) и внедрили такой измененный генетический материал в культуры клеток яичников китайского хомячка для последующей выработки химерных белков. Химерными они называют потому, что, подобно Химере из древнегреческой мифологии – монстру с головой и шеей льва, туловищем козы и хвостом в виде змеи, – эти белки также состоят из различных частей: из «каркаса» (константной части) человеческих антител, составляющего примерно 70 %, и на 30 % из фрагментов мышиных антител. Первое появившееся на рынке химерное терапевтическое моноклональное антитело – абциксимаб (торговая марка ReoPro), одобренное FDA в 1994 году, – предназначалось для предотвращения агрегации (склеивания) тромбоцитов во время оперативных вмешательств.

Создание химерных антител было шагом к меньшей токсичности, однако их достаточно крупные мышиные фрагменты все же вызывали иммунную реакцию. Поэтому следующим улучшением стало создание гуманизированных антител – с процентным соотношением человеческой и мышиной частей уже 95:5, а затем и полностью человеческих (на 100 %) антител.

Один из способов выработки человеческих антител основан на использовании трансгенных мышей, которые при иммунизации активируют внедренные гены человеческого, а не мышиного иммуноглобулина. И все большее распространение получает так называемый метод фагового дисплея, разработанный американским биологом Джорджем Смитом (род. 1941) и адаптированный британским биохимиком Грегом Уинтером (род. 1951) для направленного отбора антител. За эти работы они удостоились Нобелевской премии по химии в 2018 году.

Основан метод на использовании достаточно простых по устройству вирусов-бактериофагов, размножающихся в бактериальной клетке (кишечной палочке E. coli). Если в участки генома бактериофага, кодирующие белок оболочки вируса, вставить ген, кодирующий пептид (фрагмент белка), то этот пептид будет синтезирован на поверхности бактериофага. Такие генно-модифицированные фаги можно легко выделить из «остальной толпы» благодаря способности связываться с целевым антигеном. В геном бактериофагов можно встраивать не одну целевую последовательность, кодирующую активную часть антитела, а миллионы (например, набор генов антител в человеческих АОК), которые кодируют антитела, получив так называемые фаговые библиотеки. В каком-то смысле фаговые библиотеки являются подобием популяции В-лимфоцитов, каждый из клонов которых производит один вид антител. Выделив из популяции конкретный фаг, обладающий аффинностью к целевому антигену, его можно размножить в бактериальных клетках E. coli, а затем, используя методы генной инженерии, сконструировать на основе целевой последовательности фага набор генов антитела для его выработки, например в культурах клеток яичников китайского хомячка.

Метод фагового дисплея может использоваться в качестве замены гибридом – в таком случае все равно требуется иммунизация животных и забор АОК для создания естественной иммунной библиотеки. Но гораздо большие перспективы (и трудности) сулит использование синтетических библиотек, когда искусственно синтезируют последовательности, кодирующие антитела, не вызывающие иммунную реакцию у человека.

Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных, или гуманизированных, антителах. Уже одобрено более 80 препаратов на основе моноклональных антител, а общий объем их продаж в 2020 году составил $106,87 миллиарда.

Какую же цель атакуют антитела в случае опухолевых клеток? Антигены, находящиеся только на опухолевых клетках, называются опухоль-специфичными антигенами (tumor-specific antigen, TSA), а антигены, чей повышенный уровень отмечается в таких клетках, – опухоль-ассоциированными антигенами (tumor-associated antigen, TAA). Логично нацелить антитела как раз против таких антигенов.

Пожалуй, самый известный и широко применяемый препарат из этой группы в гематологии – ритуксимаб (ритуксан, мабтера). Это моноклональное антитело, связывающееся с белком CD20, который находится только на поверхности В-клеток. Он убивает зрелые В-лимфоциты, ведь в крови пациентов с болезнями лимфатической системы они представляют собой по большей части опухолевые клетки, но не вредит гемопоэтическим стволовым клеткам, которые не имеют антигена CD20 на своей поверхности. Избавляясь от В-лимфоцитов, мы даем организму шанс начать производить новые здоровые клетки, и уже через 12 месяцев уровень В-лимфоцитов полностью восстанавливается. Ритуксимаб позволил вывести лечение онкологических пациентов на качественно новый уровень: в 1997 году его одобрили для лечения B-клеточных неходжкинских лимфом. Ритуксимаб находится в перечне основных лекарственных средств ВОЗ, в списке наиболее важных лекарств, необходимых в базовой системе здравоохранения (WHO Model List of Essential Medicines).

Алемтузумаб (мабкэмпас, кэмпас) – гуманизированное моноклональное антитело к антигену CD52, вызывающее лизис (растворение) лимфоцитов, в котором только участки, связывающиеся с антигеном, имеют крысиное происхождение, а вся остальная часть молекулы – человеческое. После многочисленных исследований алемтузумаб был одобрен в 2001 году для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) – наиболее частого вида лейкоза у взрослых. Молекулы антигена CD52 покрывают 5 % всей клеточной поверхности зрелых лимфоцитов (и отсутствуют на поверхности стволовых), что объясняет высокую эффективность алемтузумаба в отношении ХЛЛ и Т-клеточных лимфом.

Но опухолевые клетки – непростая цель. В них часто происходят мутации, в том числе связанные с поверхностными антигенами, из-за чего часть клеток избегает воздействия моноклонального антитела. Главным достоинством моноклональных антител является их специфичность, но чем специфичнее антитело, тем больше шансов у опухолевых клеток ускользнуть от его внимания.

Однако опухолевую «крепость» можно не штурмовать, а просто осадить, перекрыв ей пути поступления пищи. Существуют антитела, способные заблокировать действие фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Они подавляют рост новых сосудов в опухоли, после чего она начнет гибнуть из-за недостатка поступающих питательных веществ.

Выше я уже писал, что настоящим прорывом стало использование моноклональных антител в качестве ингибиторов иммунных чекпоинтов. Иммунные чекпоинты – это рецепторы на клетках иммунной системы, а также некоторых нормальных клетках организма, взаимодействие с которыми помогает иммунным клеткам избирательно уничтожать чужеродные агенты, не затрагивая при этом клетки собственного организма.

В норме так и происходит, но, как оказалось, опухоли научились подавлять противоопухолевый иммунитет. Бесконтрольно размножающиеся клетки опухоли ставят «дымовую завесу», продуцируя молекулы, обманывающие рецепторы T-лимфоцитов, в результате чего последние перестают бороться со злокачественными клетками. Ингибиторы иммунных чекпоинтов блокируют ошибочное «узнавание» иммунными клетками опухолевых как своих, то есть рассеивают «дымовую завесу» опухолевых клеток, а также помогают взбодриться Т-лимфоцитам. Это позволяет иммунной системе «очнуться» и вновь начать идентифицировать раковые клетки как чужаков, нацеливая на них всю свою недюжинную мощь и уничтожая «диверсантов». Эти препараты отлично работают с такими видами рака, как меланома, рак легкого, и на сегодняшний день успешно применяются в лечении лимфомы Ходжкина.

Пока открыты два таких чекпоинт-ингибитора: цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA4) и PD-1 (PD – programmed death, то есть запрограммированная смерть). Названия устрашающие, что, впрочем, не помешало Джеймсу Эллисону собрать музыкальную группу и назвать ее в честь своего удостоенного Нобелевской премии открытия – The Checkpoints, она играет блюз, и у нее даже состоялся тур.

В 2013 году журнал Science назвал иммунотерапию рака прорывом года, потому что ее внедрение революционизировало онкотерапию, позволив продлевать жизнь пациентов на поздних стадиях рака, не реагирующих ни на какое другое лечение. Журналист The New York Times Мэтт Риктел в своей книге «Элегантная защита» описывает случай, когда у больного с лимфомой Ходжкина за 10 дней после начала приема ниволумаба (ингибитора PD-1) рассосалась восьмикилограммовая опухоль.

C механизмом работы моноклональных антител мы ознакомились, давайте разберемся с их странными именами. До того как прийти в медицину, я наивно полагал, что все эти трудновыговариваемые названия лекарств придумываются из головы. Но нет, существуют специальные правила, действующие с 1953 года, для международных непатентованных наименований (так называемых генерических наименований), определяющие активные фармацевтические ингредиенты. Это позволяет специалистам понять, что фармацевтическое вещество принадлежит к группе препаратов, обладающих схожей фармакологической активностью.

В отношении номенклатуры моноклональных антител с 2008 по 2017 год действовали рекомендации ВОЗ, согласно которым генерическое наименование должно было содержать следующие элементы:

уникальный префикс, в случае ритуксимаба (Rituximab) это «ри/ri»;

аффикс, определяющий клиническую цель: «ту(м)/tu(m)» означает, что основное действие направлено на опухоль (tumor), «ли(м)/li(m)» – на иммунную систему и т. д.;

аффикс, характеризующий происхождение, в случае ритуксимаба (Rituximab) – это «кси/xi» (химерное, chimeric), «зу/zu» – гуманизированное, «у/u» – человеческое, «о/o» – мышиное;

суффикс «маб/mab» – моноклональное антитело (monoclonal antibody).

Отсюда и такие странные и страшные названия: алемтузумаб, офатумумаб, брентуксимаб, пембролизумаб. Кажется, если произносить их быстро-быстро, получатся заклинания на псевдолатыни, которые вдалбливают в головы учеников Хогвартса.

Впрочем, «заклинания» эти далеко не всемогущи. В нынешнем виде антитела – это довольно крупные молекулярные конструкции, которые не могут проникать внутрь клетки или глубоко в ткани. Они, как я уже говорил, представляют собой белки-иммуноглобулины и делятся на пять классов, но основную массу иммуноглобулинов плазмы крови человека (75‒85 %) составляют иммуноглобулины класса G (IgG). По образному описанию академика Рэма Петрова, иммуноглобулины классов D, E, G по строению схожи с мальчишеской рогаткой, где две длинные (тяжелые) цепи, располагаясь рядом друг с другом, формируют «рукоятку», а в месте разветвления образуют внутренние стороны «рожков». Короткие (легкие) цепи примыкают к тяжелым после развилки, образуя уже наружные стороны «рожков». Концы «рожков», состоящие из цепей двух типов, определяют аффинность; таким образом, антитело имеет два активных центра. Иммуноглобулины класса A (IgA) представляют собой две «рогатки», соединенные встык в основаниях «рукояток», и имеют четыре активных центра, а иммуноглобулины класса M (IgM) составлены в форме звезды из пяти «рогаток», обращенных «рожками» наружу, то есть имеют 10 активных центров.

Но в 1993 году группа бельгийских исследователей под руководством Раймонда Хамерса обнаружила в крови одногорбых верблюдов, помимо классических антител, еще и необычные, очень маленькие антитела – «рогатку» образуют лишь две укороченные тяжелые цепи, а легкие отсутствуют. Благодаря небольшим размерам «верблюжьи» антитела (сейчас они известны как «наноантитела» или «однодоменные антитела») способны попасть в те клетки и ткани организма, куда не могут проникнуть классические иммуноглобулины, легче выводятся почками, к тому же устойчивы к деградации в желудочно-кишечном тракте. В перспективе препараты на основе наноантител можно будет применять внутрь или ингаляционно. Всем этим объясняется интерес, который они вызывают у исследователей и биофармацевтических компаний. В практике наноантитела уже применяются в целях диагностики, в частности, некоторых факторов свертываемости. Клинические исследования проходят наноантитела, блокирующие VEGF, так что можно ожидать, что в недалеком будущем арсенал медиков пополнится новым мощным и удобным оружием.