Глава 35
Формирование микробиологии как самостоятельной науки
Успехи микробиологии во второй половине XIX в. позволили французскому историку науки П. Таннери сказать: «Перед лицом бактериологических открытий история других естественных наук за последние десятилетия XIX столетия кажется несколько бледной».
Необыкновенная плодотворность и высокий темп развития микробиологии в этот период были обусловлены качественно новым подходом к изучению микроорганизмов и созданием новых методик микробиологических исследований. На смену прежним умозрительным гипотезам и описательным работам морфологов и систематиков пришли экспериментальные исследования жизнедеятельности микроорганизмов, их физиологической специфичности и химической идентификации продуктов их жизнедеятельности. Возникновение нового физиологического направления в микробиологии, базирующегося на точном эксперименте, связано главным образом с именем Л. Пастера.
Центральными проблемами этого периода оставались: проблема происхождения инфекционных болезней, природа процессов брожения и гниения и самозарождения микроорганизмов. Кроме того, выяснилась важность широкого изучения роли микроорганизмов в круговороте веществ в природе. Возникновение этого нового — экологического — направления в микробиологии также было связано с идеями Пастера о повсеместном распространении микроорганизмов, об их высокой видовой специфичности и влиянии на их жизнедеятельность различных экологических факторов.
К началу второй половины XIX в. в области этиологии инфекционных заболеваний еще только накапливались факты, свидетельствовавшие об активной роли живых микроскопических существ в возникновении и передаче многих заболеваний. Однако эта гипотеза еще не была фактически обоснована и наряду с ней существовала другая, согласно которой микробы считались не причиной, а следствием возникновения болезней. Наиболее распространенным оставалось представление, что причиной возникновения инфекционных болезней является разложение соков организмов, способное передаваться от одного человека к другому.
Первые свидетельства микробной природы болезней.
Первым, кто реально доказал, что болезнь может вызываться живым организмом — криптогамным грибком (мюскардиной) — был итальянец А. Басси, в 1837 т. обнаруживший факт передачи болезни при переносе этого грибка от одного шелковичного червя к другому. Естественно было предположить, что и в основе патологии человека лежит то же явление. Однако развитие теории микробного происхождения болезней человека столкнулось с научным авторитетом Ю. Либиха, который считал причиной возникновения болезней нарушения в течении химических процессов в организме.
Совершенствование микроскопа содействовало повышению интереса врачей к микроскопическому изучению тканей и крови больных людей. Поисками паразитирующих микроорганизмов занимались во многих лабораториях, и факты, подтверждающие участие микробов в инфекционных заболеваниях, следовали один за другим. В 1839 г. берлинский физик и клиницист Д. Шенлейн открыл паразита, вызывающего паршу (названного впоследствии Achronion schönleini). В 1846 г. патолог Я. Генле, ученик И. Мюллера, в книге «Руководство по рациональной патологии» дал четкую формулировку теории непосредственной связи между инфекциями и живыми возбудителями. Его строго аргументированные, подтвержденные многочисленными примерами выводы о болезнетворной роли «контагия», попадающего в тело и размножающегося в нем, нашли много сторонников, среди которых были и такие деятели медицины, как М. Петтенкофер, Э. Клебс и др. И хотя самому Генле не удалось увидеть ни одного возбудителя инфекционной болезни человека, его идеи послужили толчком к еще более интенсивным поискам болезнетворных микроорганизмов. В итоге в течение второй половины XIX в. были открыты возбудители наиболее распространенных бактериальных заболеваний человека и животных.
Иллюстрацией развития проблемы этиологии инфекционных болезней может служить история открытия и изучения возбудителя сибирской язвы — Bac. anthracis.
Огромные потери скота, погибавшего от частых вспышек эпидемии сибирской язвы, не могли быть объяснены деятельностью уже известных к тому времени микробов. Пытаясь выяснить причину гибели животных, немецкий анатом Ф. Поллендер тщательно исследовал под микроскопом кровь павших от сибирской язвы лошадей и в 1849 г. обнаружил в ней микроскопические нити из неподвижных бацилл. Однако он не сделал вывода, что они были причиной начала болезни, ограничившись общей постановкой вопроса. В следующие годы факт присутствия бацилл в крови больных животных подтвердили П. Рейяр (1850) и К. Давэн (1851). В 1858 г. профессор Дерптского ветеринарного института Ф. Брауэлл попытался профильтровать жидкость с бациллами, в результате чего получил фильтрат, утративший свою инфекционность. Однако и он не связал этот факт с наличием в крови больных животных болезнетворных возбудителей, ограничившись установлением контагиозности крови. В 1860 г. французский врач Д. Деляфо провел микроскопические наблюдения, в результате которых установил, что обнаруженные им микроорганизмы способны к размножению в капле крови на предметном стекле. Автор причислил их к растительным организмам и описал образование у них спор. Это было сделано за 15 лет до того, как сибиреязвенные споры описал Р. Кох, которому всецело приписывается честь открытия этого факта. Однако и Деляфо не связал этиологию заболевания с наличием микроорганизмов в крови больных животных.
К концу 50-х годов XIX в. стали известны исследования Пастера, который со всей определенностью утверждал, что процессы брожения и гниения вызываются микроорганизмами. Именно эти исследования Пастера послужили для Давэна стимулом к возобновлению опытов по изучению сибирской язвы, в результате которых он сделал вывод (1863) о наличии непосредственной связи между заболеванием и присутствием в крови описанных им ранее (1851) палочек и нитей, названных Давэном бактеридиями. В своих многочисленных трудах, явившихся итогом десятилетнего изучения сибирской язвы, Давэн не только доказал контагиозность крови, содержащей бактериальные нити, но и впервые отметил их несомненное отличие от микробов, обнаруживаемых в гнойниках при септицемии. Он даже пытался разработать лечение сибирской язвы путем использования антибактериальных свойств листьев орешника.
Вероятно, эти опыты Давэна следует рассматривать как первую попытку применения антибиотиков. Однако, несмотря на необычайную тщательность и продуманность опытов Давэна, его выводы встретили весьма скептическое отношение. Это вынудило его прекратить свои работы в 1873 г. И только классические исследования Пастера и Коха в 60-70-е годы показали, насколько значительным был вклад Давэна в изучение микробной природы сибирской язвы.
Установление Р. Кохом этиологии сибирской язвы и туберкулеза. Вклад Коха в бактериологию.
Раскрытие этиологии сибирской язвы и многих других инфекционных заболеваний связано с именем Р. Коха, основателя немецкой школы микробиологов. Будучи сельским врачом, Кох столкнулся в своей практике с рядом тяжелых заболеваний скота, в том числе с сибирской язвой. Пытаясь распознать этиологию этого заболевания, Кох опирался в своих исследованиях на положения микробной теории инфекционных заболеваний. Это и позволило ему найти верный ключ к решению проблемы. Микроскопическое изучение тканей больных животных выявило сильную пораженность селезенки бациллами сибирской язвы. Кох тщательно изучил их и установил влияние внешних факторов на вегетативные формы бацилл и их споры. В противоположность Давэну, он утверждал, что главным очагом заразы являются трупы животных, изобилующие спорами бациллы, а не живые организмы.
Роберт Кох. 1843–1910.
В 1876 г., т. е. спустя четыре года после начала работ, никому не известный в то время врач Кох написал о своих исследованиях крупному немецкому микробиологу Ф. Кону и в его лаборатории с успехом продемонстрировал свои опыты. Резюмирующая эти исследования статья Коха «Этиология сибирской язвы на основе истории развития Bac. anthracis», опубликованная в 1877 г., положила начало точным знаниям об этиологии инфекционных болезней.
Получив возможность всецело заняться научной работой, Кох наибольшее внимание уделил разработке методов бактериологических исследований. Он сконструировал осветительный аппарат, разработал новые совершенные методы окрашивания бактерий анилиновыми красками, а также способы выращивания анаэробов в прозрачных жидких средах. Немалое значение имело и изобретение Кохом приемов микрофотографирования бактерий, простых и эффективных методов культивирования микробов в искусственной среде. От выращивания бацилл во влажной камере в водянистой влаге глаза быка он перешел к культивированию на желатине и получил чистые культуры бактерий путем изолирования отдельных бактериальных клеток. Этому содействовало применение сконструированного Кохом тогда еще весьма примитивного термостата.
В последующие годы Кох совместно со своими ассистентами Г. Вольфхюгелем, Г. Гаффки, Ф. Лефлером, разрабатывая методы стерилизации и дезинфекции, ввел дальнейшие усовершенствования в бактериологическую технику. Особое значение для развития микробиологии имел разработанный им метод выращивания чистых культур в чашках Петри. Этот метод, получивший название метода Коха, разрешил проблему выделения в виде чистых культур возбудителей холеры, дифтерии, сапа, чумы, крупозного воспаления летних. Эти исследования, а также три вышедшие одна за другой работы «Об этиологии сибирской язвы» (1876), «О методах окрашивания и фотографирования бактерий» (1877) и «Исследования этиологии инфекции ран» (1878) принесли Коху широкую известность.
В 1882 г. Кох открыл возбудителя туберкулеза. Со времени экспериментов Виллемина (1868) считалось, что туберкулез вызывается неизвестной разновидностью вируса (до работ М. Бейеринка в 1897 г., вложившего в понятие вирус современное содержание, слово вирус употреблялось для обозначения токсинов, выделяемых микробами в тело животного). Применив метод окрашивания бактерий кислыми красками, Кох выделил в чистую культуру кислотоустойчивые формы бактерий, которыми можно было вызвать туберкулез у многих чувствительных к нему животных (1884). Изучение Кохом этиологии туберкулеза имело огромное значение для медицины. За исследования туберкулеза Р. Кох был удостоен в 1905 г. Нобелевской премии.
Кох экспериментально обосновал и развил выдвинутые ранее Генле общие положения для распознания инфекционных заболеваний, вошедших в науку под названием «правил Коха» (1882). Эти правила сводились к следующему: 1) подозреваемый микроорганизм должен регулярно обнаруживаться в случае болезни; 2) он должен быть изолирован в чистую культуру; 3) эта чистая культура, будучи введена в восприимчивый организм, должна вызвать у него ту же болезнь; 4) тот же микроорганизм должен быть вновь изолирован из зараженного животного.
Правила Коха получили широкое применение в медицинской практике, хотя, как выяснилось позднее, некоторые из них оказались неприменимыми к ряду заболеваний.
Последующие исследования возбудителей холеры (1883), чумы рогатого скота в Южной Африке (1896), бубонной чумы в Бомбее (1897) и сонной болезни в Восточной Африке (1906–1907) упрочили мировую славу Коха как выдающегося микробиолога XIX в. Кох создал большую научную школу, к которой относятся Э. Клебс, К. Эберт, Э. Беринг, Ф. Лефлер, Э. Смит и многие другие.
Изучением этиологии сибирской язвы — одной из важных проблем в микробиологии XIX в. — занимался Пастер и его школа. Пастер провел детальные исследования вопросов происхождения и распространения сибирской язвы, в результате которых дал научное обоснование профилактических мероприятий по борьбе с этой болезнью. Путем тщательного микроскопического изучения и разносторонних экспериментальных исследований Пастер продемонстрировал непосредственную связь между наличием «бакдеридий» сибирской язвы и их спор с возникновением болезни, сопровождающейся конкретными клиническими симптомами. Заслугой Пастера является также изучение морфологических и физиологических особенностей «бактеридий», в результате которых были разработаны меры предупреждения и распространения сибирской язвы (воздействием температурного фактора, изменениями условий влажности и аэрации).
Начало научной деятельности Л. Пастера. Изучение брожения.
Творчество Пастера чрезвычайно многогранно. Оно охватывало все области микробиологии — изучение самопроизвольного зарождения, природы брожения, этиологии инфекционных заболеваний, проблемы иммунологии и вакцинации и многие другие. Для каждого из этих направлений деятельность Пастера имела основополагающее значение.
Луи Пастер. 1822–1895.
Творчество Пастера — яркий пример плодотворной связи науки с практикой. Объектами большинства его исследований были явления, имевшие непосредственное практическое значение. Часто это были проблемы, которые называют прикладными, проблемы, связанные с технологией различных производств. Пастер на протяжении всей своей жизни последовательно переходил от одной «производственной», выдвинутой практикой, проблемы к другой и решал их. Завершить исследование для него всегда означало усовершенствовать технологию или устранить вредное влияние тех или иных явлений. Но этот завершающий этап исследования всегда был у Пастера результатом глубокого проникновения в сущность явления, всестороннего теоретического осмысления практических и экспериментальных данных. Поэтому его работы, имевшие огромное практическое значение, одновременно становились вехой в развитии науки.
Деятельность Пастера в области микробиологии началась в 1857 г. с работ в области молекулярной диссимметрии, принесших ему широкую известность в кругу химиков. Толчком к изучению брожений послужило явление, случайно подмеченное Пастером в одном из опытов с рацемической винной кислотой. Пастер установил, что плесневой гриб, выросший в растворе этой кислоты, потреблял правую винную кислоту, оставляя без изменения ее левый изомер. Интерес к этому явлению еще более возрос у него во время пребывания в Лилле (1855–1858 гг.) — центре винокуренной и пивоваренной промышленности Франции. Мысль о том, что микроскопический гриб, выросший в растворе рацемической кислоты, явился причиной ее расщепления, была первым исходным положением, приведшим Пастера к обоснованию физиологической природы воздействия микробов на окружающий субстрат.
Пастер начал свои исследования брожений с иных позиций, чем те, которых придерживались Митчерлих, Берцелиус и Либих — сторонники химической природы брожений (см. главу 20). Пастеру удалось опровергнуть химическую трактовку сущности брожений постановкой чрезвычайно простого и вместе с тем убедительного опыта на безбелковой неорганической среде, в которую вводилось небольшое количество дрожжей. Энергичное брожение и увеличение дрожжевой массы в этой среде полностью опровергло мнение противников биологической доктрины брожений, отводивших молекулярным движениям альбуминоидных (белковых) веществ (которые в этой среде полностью отсутствовали) роль активного начала во всем процессе брожения. Пастер, таким образом, отчетливо показал, что брожение — это результат проявления жизнедеятельности живых микроорганизмов — дрожжей, питающихся и размножающихся за счет сахара и минеральных солей, присутствующих в питательной среде.
Изучение маслянокислого брожения, протекающего в бескислородной среде (в ходе этих исследований Пастер в 1861 г. указал на различие возбудителей маслянокислого и молочнокислого брожения вопреки существовавшему мнению об их идентности), привело его к выводу огромной принципиальной важности — жизнь некоторых микробов не только возможна в отсутствии кислорода, но требует его полного исключения из окружающей среды. Этот вывод снимал все возражения либиховской теории, согласно которой кислород сообщал белковым частицам первый толчок к внутреннему движению. Говоря о результатах своих исследований, Пастер писал: «В настоящий момент моя вполне определившаяся точка зрения …сводится к следующему. Химический процесс брожения представляет собою явление, тесно связанное с жизнью, начинающееся и заканчивающееся вместе с последней… Результаты исследований, приведенные в этом мемуаре, находятся, по-моему, в полном противоречии со взглядами Либиха и Берцелиуса».
Исследования Пастера привлекли на его сторону многих последователей. Более того, некоторые из его противников, в том числе Митчерлих и Берцелиус, отказались от своих прежних взглядов. Восторжествовала биологическая доктрина брожения, сформулированная Пастером: нет брожения без жизни микроорганизма; брожение есть жизнь без кислорода. Эти положения Пастер распространил на все виды брожений, а также на гниение и тление.
С микробиологических позиций Пастер подошел и к изучению образования уксуса (1864). Он не только доказал, что причиной образования уксуса является особый микроорганизм — Mycoderma aceti, окисляющий вино в уксус, но и путем изучения жизнедеятельности этого микроба разработал методы технологического усовершенствования процесса изготовления уксуса. Рекомендации Пастера для предотвращения первоначальной порчи вина путем его прогревания при 55–60° в течение получаса под названием «пастеризация» получила широкое применение в пищевой промышленности.
Большое сочинение о брожениях «Исследования о пиве» (1876) — плод многолетнего труда Пастера — всесторонне обосновало физиологическую теорию брожения. Одновременно оно содержало ценные практические указания.
Пастер всегда строго придерживался «жизненной» сущности брожений, усматривая в этом процессе проявление деятельности живых неповрежденных клеток микроорганизмов. По-видимому, эта позиция Пастера была связана с тем, что его всегда интересовал не столько механизм брожения, сколько причинные отношения между брожением и жизнедеятельностью микробов. Неудивительно, что попытки М. Бертло, К. Бернара и других отрицать связь брожения с жизнью дрожжей неизменно встречали со стороны Пастера самую резкую критику. В своем «Критическом разборе посмертной работы Клода Бернара о брожении» Пастер порицал великого физиолога, предпринявшего в последние годы своей жизни изучение природы спиртового брожения, за попытку отрицать наличие непосредственной связи между образованием спирта в виноградном сусле и жизнью дрожжей.
Тем не менее, Пастер одновременно допускал участие ферментов дрожжевых клеток в осуществлении химических превращений во время брожения и, по свидетельству ученика и сотрудника Пастера Э. Ру, даже пытался путем растирания дрожжевой массы с песком и замораживанием выделить их из дрожжевых клеток. Однако неудавшаяся попытка вызвать брожение с помощью полученной дрожжевой массы привела Пастера к полному отрицанию возможности получить брожение с помощью бесклеточного препарата. Как выяснилось позднее из работ братьев Г. и Э. Бухнеров (1897), получивших из низовых дрожжей активный бесклеточный сок, вызывающий спиртовое брожение, далеко не все расы дрожжей дают такой сок. По-видимому, в силу указанного обстоятельства Пастер, работавший с расой дрожжей верхового брожения, не получил активный дрожжевой сок.
Опровержение Л. Пастером теории самопроизвольного зарождения микроорганизмов.
Логическим продолжением исследования явлений брожения было изучение проблемы самопроизвольного зарождения, к которому Пастер приступил с начала 60-х годов XIX вв. Весь ход изучения брожений дал в руки Пастера неопровержимые доказательства того, что брожение в тех средах, которые он употреблял, вызывается микроорганизмами, попадающими извне.
Как уже указывалось (см. главу 20), Т. Шванн, Ф. Шульце, Г. Шредер и Т. фон Душ получили данные, свидетельствовавшие против самозарождения. Однако случаи самопроизвольного загнивания простерилизованных жидкостей в хорошо закрытых сосудах неизменно дискредитировали позиции противников теории самозарождения.
Теперь известно, что причиной подобных результатов могло быть наличие в питательных жидкостях микроорганизмов или их спор, выдерживающих нагревание до 100°. Только в 1876 г. Р. Кох на примере бацилл сибирской язвы, а в 1877 г. Ф. Кон на спорах сенной бациллы показали, что споры этих микроорганизмов могут быть убиты только при нагревании в течение длительного времени при температуре, превышающей 100°.
Однако, по-видимому, более существенной причиной того, что спор по вопросу о самозарождении так надолго затянулся, было отсутствие общей теории, которая могла бы осветить имеющиеся факты. Поэтому, когда в 1858 г. известный французский натуралист, Ф.А. Пуше впервые выступил с изложением результатов своих исследований, являвшихся, по его мнению, неопровержимым доказательством правильности принципов гетерогении (термин, предложенный Пуше для самозарождения), спор о возможности самозарождения возродился с новой силой. Этому способствовал также выход в свет в 1859 г. «Происхождения видов» Ч. Дарвина, вызвавший живой интерес к вопросам происхождения и эволюции жизни, в том числе и ее низших форм — микроорганизмов. В 1859 г. Французская Академия наук объявила конкурс на изучение темы, сформулированной следующим образом: «Попытаться при помощи хорошо поставленных опытов осветить по-новому вопрос о самопроизвольном зарождении».
К этому времени Пастер, уже вооруженный результатами своих исследований брожений, выступил против защитников гетерогении. Требовалось выяснить основной вопрос: действительно ли один кислород при контакте с азотистыми веществами обеспечивает самопроизвольное появление организованных существ, как утверждали гетерогенисты, или его функция сводится к тому, что он способствует размножению в органических средах одновременно попавших с ним зародышей микробов.
Исследовательский талант Пастера сказался в данном случае в постановке простого, но чрезвычайно убедительного опыта, доказавшего несостоятельность аргументации всех защитников теории самозарождения микроорганизмов. С помощью S-образной трубки, на изгибах которой оседала пыль вместе с попадающими из воздуха микробами, которые, если их смыть в прокипяченный бульон, вызывали его загнивание, Пастер неопровержимо доказал, что не кислород, а попавшие извне микробы могут быть причиной загнивания, а атмосферный воздух лишь способствует размножению микробов, которые в благоприятных для них условиях воспроизводят себе подобных. Французская Академия наук присудила в 1862 г. премию Пастеру не только за вполне удовлетворительное разрешение проблемы, но и за точную и вполне убедительную постановку опыта. Все последующие попытки возродить теорию самозарождения (А. Бастиан, Э. Фреми, П. Вешан и др.) были опровергнуты Пастером.
Выводы Пастера не удовлетворительны лишь в том отношении, что он не принимал во внимание резистентность спор некоторых бактерий к нагреванию, о существовании которых не знал. В своих работах Пастер не касался вопроса о возникновении жизни на Земле в его философском и биологическом аспекте. Речь шла только о возможности самозарождения микробов, и в этом плане опыты Пастера принципиально полностью разрешали эту проблему в ее первоначальной форме.
Подтверждение Л. Пастером микробной теории инфекционных заболеваний.
В 1865 г. французское правительство предложило Пастеру оказать помощь промышленности, страдавшей от болезней шелковичных червей. Изучение этой проблемы заняло у Пастера около пяти лет и принесло ему широкую известность. Это была первая работа Пастера по этиологии инфекционных болезней, положившая начало его блестящим исследованиям в области медицинской микробиологии.
Подтвердив путем тщательных микроскопических исследований наличие непосредственной связи между возникновением болезни и присутствием в телах червей микроскопических образований, а также заразность болезни, и установив время ее максимального проявления, Пастер показал, что болезнь шелковичных червей, называемая пебриной, отличается от другой болезни — фляшери, распознание которой значительно затруднено нерегулярностью выявления ее возбудителя. Лабораторные исследования Пастера привели его к важным практическим рекомендациям: для избежания заболевания следует искать под микроскопом в телах бабочек и куколок шелкопряда микроскопических возбудителей и отбирать грену только здоровых бабочек; создавать благоприятные условия содержания червей, так как развитие фляшери стимулируется их плохим содержанием и ослабленным физиологическим состоянием. Эти выводы и рекомендации Пастера легли в основу системы предупреждения и мер борьбы с болезнями шелковичных червей.
Джозеф Листер. 1827–1912.
В рассматриваемый период в медицинских кругах, несмотря на отдельные голоса в защиту микробного происхождения инфекционных болезней (труды П. Рейяра, Ф. Врауэлла, К. Давэна, Р. Коха), еще царил консерватизм в толковании причин возникновения заразных болезней. Вооруженный результатами своих исследований брожений, проблемы самопроизвольного зарождения, болезней шелковичных червей Пастер начал отстаивать теорию микробного происхождения инфекционных болезней человека. Первым его выступлением в этом направлении было доказательство того, что родильная горячка, чрезвычайно распространенная в то время во Франции, вызывается не гнилостным запахом, как тогда полагали, а является результатом передачи ее микроскопического возбудителя самим медицинским персоналом, пренебрегавшим правилами антисептики. Тщательными микроскопическими наблюдениями Пастер выявил возбудителя горячки и разработал методы защиты от его проникновения в организм, что послужило основой развития антисептики, совершившей переворот в хирургии.
Создатель теории антисептики, основанной на гипотезе микробного происхождения болезней, английский хирург Дж. Листер с успехом разрабатывал в медицине идеи Пастера. Тщательные исследования Листера по этиологии большого числа инфекционных заболеваний, доказавшие болезнетворную роль многих микроорганизмов, решили проблему антисептики. Использование методов химической стерилизации ран (антисептика) и физической стерилизации хирургических инструментов (асептика), разработанных Листером, способствовало подтверждению микробной природы многих заболеваний.
Создание Л. Пастером учения об иммунитете.
В 1879 г. Пастер начал изучение куриной холеры. Первый вывод из этих исследований сводился к тому, что физиологическое состояние птиц — существенный фактор в возникновении и протекании болезни. Случайно обнаруженное явление — сильное ослабление вирулентности культуры микроба после продолжительного периода ее хранения и отсутствие заболевания у кур, которым после введения этой ослабленной культуры вводилась свежая, вирулентная культура — послужило основой для создания теории иммунитета. Возможность иммунизации животных и человека была подтвержден Пастером в его исследованиях по изысканию методов борьбы с сибирской язвой и бешенством. Пастер показал, что при выращивании культуры бацилл сибирской язвы в условиях повышенной температуры, можно получить бесспоровую культуру со значительно ослабленной вирулентностью, с помощью которой удавалось успешно иммунизировать животных от заболевания сибирской язвой.
Еще более блестящие результаты дали исследования Пастера в области иммунизации против бешенства. Эти исследования, составившие яркую страницу в истории микробиологии XIX в., полностью рассеяли мрак, окружавший происхождение и распространение различных форм бешенства. Причина возникновения и природа бешенства долгое время были предметом споров. В результате тщательных исследований, проводившихся Пастером совместно с Э. Ру, было показано, что местом сосредоточения микробов бешенства является не слюна, как утверждалось ранее, а главным образом нервная система, в частности продолговатый мозг. Из высушенного мозга, пораженного микробом бешенства, приготовлялась эмульсия. Введением этой эмульсии, обладавшей пониженной вирулентностью, достигалась полная невосприимчивость иммунизированных животных и человека к бешенству.
Исследования Пастера в области предохранительных прививок заложили основу учения об иммунитете — одного из важнейших достижений науки XIX в. Представления о восприимчивости организма к инфекции и о невосприимчивости, или иммунитете, получили научное развитие благодаря успехам, достигнутым микробиологией в целом. Это дало возможность поставить вопрос о защите организма от инфекционных болезней. Предполагалось, что кровь воздействует на попавшее в организм болезнетворное начало угнетающе. Однако о механизме этого воздействия ничего не было известно. Существовали две гипотезы: либо кровь осаждает болезнетворный фактор в какой-либо части тела, и вследствие этого он теряет свою инфекционностъ, либо он разрушается под действием кровяной сыворотки.
Институт Пастера в Париже.
Первые попытки создать теорию иммунитета связаны с обнаружением явления приобретенного иммунитета, как наиболее улавливаемой его формы. В 1878 г. Пастер, основываясь на том, что питательная среда, на которой культивировались микробы и от которой они затем отфильтровывались, становится, по его мнению, непригодной для нового посева этих же микробов вследствие поглощения из нее какого-то необходимого питательного ингредиента, предложил для объяснения приобретенного иммунитета теорию «истощения».
Различные толкования механизма иммунитета. Фагоцитарная теория И.И. Мечникова.
В 1888 г. О. Шово, пытаясь объяснить механизм иммунитета, предположил, что при вакцинировании микробы выделяют в организм вещество, препятствующее развитию тех же микроорганизмов при их вторичном введении. Эта теория «прибавочной субстанции», как и теория «истощения», не получила признания ввиду отсутствия сведений о природе выделяемого (первая теория) и потребляемого (вторая теория) вещества.
В 1883 г. И.И. Мечников создал биологическую — фагоцитарную теорию иммунитета. В основу этой теории была положена способность белых кровяных телец — фагоцитов — захватывать и разрушать инородные тела, попадающие в организм. Фундаментом для создания теории фагоцитоза послужила сравнительно-эволюционная трактовка явлений внутриклеточного пищеварения у одноклеточных и воспаления и иммунитета у высших животных.
Мечников установил полный параллелизм между невосприимчивостью и фагоцитозом.
Одновременно с фагоцитарной теорией иммунитета значительной поддержкой пользовалась гуморальная теория иммунитета, сущность которой сводилась к признанию защитного действия бактерицидных веществ плазмы крови и лимфы. Так, Д. Хантер еще в XVIII в. впервые отметил тормозящее действие сыворотки крови на процесс гниения, не обнаружив, однако, при этом разрушения гнилостных бактерий. В 1887 г. венгерский эпидемиолог И. Фодор сообщил о том, что он нашел скопление разрушенных сибиреязвенных бацилл в сердце больного животного, объяснив этот факт бактерицидным действием сыворотки крови. О разрушающем действии дефебринированной крови животных на микроорганизмы — Вас. subtilis, В. megatherium, Staph. aureus сообщал в 1888 г. английский бактериолог Г. Нуталль. Это свойство крови, по данным Нуталля, исчезало после нагревания ее при 56° в течение получаса.
Бактерицидные свойства сыворотки крови особенно подробно изучал далее немецкий микробиолог и гигиенист Г. Бухнер, который утверждал, что нет различия в бактерицидной активности сыворотки и свежей крови. Вещество, за счет которого создается бактерицидность сыворотки, он назвал алексином. В 1890 г. Э. Беринг продемонстрировал разрушение патогенных бактерий в изолированных кровеносных сосудах, лишенных крови, но заполненных плазмой.
Все эти данный в конечном итоге оформились в теорию бактерицидного иммунитета, явившейся разновидностью гуморальной теории иммунитета. Она находилась в противоречии с целлюлярной теорией Мечникова. Оппозиция против фагоцитарной теории еще более усилилась, когда Ф. Лефлер в 1887 г., а вслед за ним Э. Ру обнаружили, что фильтрат культуры дифтерийной бациллы вызывает в восприимчивом организме столь же характерное течение болезни, как и свежая культура этих бацилл. Авторы пришли к заключению, что болезнетворность дифтерийных бацилл является результатом действия выделяемых ими экзотоксинов.
Последующее развитие это направление получило в трудах сотрудников Р. Коха — А. Френкеля, Э. Беринга и Ш. Китазато, показавших, что сыворотка крови иммунизированных животных обладает свойствами предохранять их от токсического действия некоторых патогенных микробов, т. е. обладает антитоксическими свойствами. Открытия столбнячного (Беринг и Китозато) и дифтерийного (Беринг) антитоксина легли в основу расшифровки механизма приобретенного иммунитета как выражения защитного действия антитоксинов, выделяемых в ходе болезни. Этот вид иммунитета получил название антитоксинного и встретил поддержку со стороны многих медиков и патологов.
В 1895 г. немецкий бактериолог Р. Пфейффер совместно с русским врачом В.И. Исаевым показали, что свежая культура холерного вибриона, введенная в брюшную полость иммунизированного животного, растворяется в ней. Это явление, получившее название «феномен Исаева-Пфейффера», оказалось сугубо специфичным по отношению к различным видам возбудителей и составило сущность бактериолитического иммунитета.
Теорию антитоксинной природы иммунитета в течение ряда лет развивал П. Эрлих. В результате этих исследований возникла новая отрасль медицины — серотерапия.
На протяжении многих лет И.И. Мечников и его многочисленные ученики (А.М. Безредка, Я.Ю. Бардах, В.К. Высокович, Л.А. Тарасевич, Г.Н. Габричевский, Н.Я. Чистович, Д.К. Заболотный и др.) вели борьбу в защиту теории фагоцитоза. Ими было показано, что каждый из известных в то время видов иммунитета — бактерицидный, антитоксинный, бактериолитический — носят лишь частный характер, а защитное действие фагоцитов имеет универсальное значение для борьбы организма с большинством инфекционных заболеваний.
Изучение участия микробов в природных процессах. Возникновение экологического направления в микробиологии.
Наряду с медицинской микробиологией в конце XIX в. сформировалось новое — экологическое направление микробиологии, связанное с изучением деятельности микробов в природных условиях и выяснением их роли в круговороте веществ в природе. Основой для развития экологического направления послужили идеи Пастера.
Центральное положение среди объектов изучения на первом этапе развития этого направления занимали почвенные микроорганизмы. Уже в 60-70-х годах XIX в. идея об активной роли специфических почвенных микроорганизмов в генезисе почв и водоемов имела значительное число сторонников среди агрохимиков и агрономов. Этому в значительной мере способствовало, с одной стороны, разочарование в теории почвенного плодородия, созданной Либихом, а с другой — огромная притягательная сила созданного Пастером учения о микробиологической природе таких издавна известных природных процессов, какими являются гниение и брожение. Истинность и огромное принципиальное значение теории Пастера все более подтверждалось потоком новых фактов. Сам Пастер не изучал почвенных микробиологических процессов. Однако его исследования в области общей микробиологии, его доктрина микробиологической сущности процессов преобразования веществ на земной поверхности указали новые пути для изучения этих явлений. Идеи Пастера оказались настолько плодотворными, что на их основе за короткий срок были открыты и изучены основные группы микроорганизмов, осуществляющих круговорот азота, углерода, серы, железа и других элементов. При этом, как правило, экологические исследования сопровождались широким изучением физиологических особенностей открываемых микроорганизмов, что способствовало одновременно развитию физиологического направления в микробиологии.
Сообщения о фактах участия микроорганизмов в природных процессах превращения веществ стали независимо друг от друга появляться в различных странах. Так, в 1877 г. французские химики Т. Шлезинг и А. Мюнц, исходя из гипотезы об «организованных ферментах», экспериментально доказали, что процесс нитрификации, считавшийся чисто химическим, является по своей природе микробиологическим, а английский бактериолог Р. Уорингтон уже в 1884 г. попытался выделить возбудителей нитрификации в чистые культуры. В 1882 г. французские исследователи Дегерен, Гайон и Дюпети установили микробиологический характер процесса денитрификации, а в 1884 г. Дегерен показал, что анаэробное разложение растительных остатков в природе осуществляется с помощью микроорганизмов.
В становлении и развитии экологического направления в микробиологии и изучении природных микробиологических процессов большая заслуга принадлежит русским ученым, которые также опирались на открытия Пастера.
Ученик Л.С. Ценковского М.С. Воронин в;1867 г. описал клубеньковые бактерии, которые, как показали в 1884–1886 гг. Гельригель и Вильфарт, осуществляют фиксацию атмосферного азота. В чистую культуру их выделил М. Бейеринк, в 1901 г. П.А. Костычевым была разработана теория микробиологической природы почвообразовательного процесса, и его по праву можно считать одним из основателей русской почвенной микробиологии. Введенный им новый, биологический подход к изучению почв основывался на учете первостепенного значения для образования почв высших, а затем низших растений — водорослей, грибов и бактерий.
Создание С.Н. Виноградским почвенной микробиологии.
Наибольшее значение для расширения научных представлений о роли микробов в круговороте веществ в природе и развития экологического направления в микробиологии имели классические исследования С.Н. Виноградского.
Ученик А.С. Фаминцына и А. де Бари С.Н. Виноградский еще в юношеские годы провел оригинальные по замыслу и убедительные по выполнению исследования физиологии и морфологии Mycoderma vint. В 80-е годы XIX в. С.Н. Виноградский принял участие в разрешении спора между поли- и мономорфистами по поводу морфологической изменчивости микробов. Стремясь критически оценить позиции обеих сторон, Виноградский провел тщательное изучение морфологии и физиологии серо- и железобактерий, культурами которых полиморфист Ф. Цопф пользовался для доказательства своих воззрений. Виноградский был первым, кто вместо обычной для того времени практики наблюдения за фиксированными препаратами, использовал метод наблюдения за живой культурой микроба в висячей капле питательной среды. Это помогло Виноградскому обнаружить примесь посторонних форм в культурах Цопфа, что и служило поводом к заключению последнего о безграничной изменчивости форм в мире микроорганизмов.
В ходе этих исследований Виноградский заинтересовался своеобразной физиологией серо- и железобактерий. При исследованиях физиологических особенностей этих бактерий Виноградский впервые применил изобретенный им метод элективных (избирательных) культур, оказавшийся чрезвычайно ценным для выделения микроорганизмов, высоко специфичных по отношению к условиям культивирования. Исключительная наблюдательность и научная интуиция позволили Виноградскому сделать вывод большой принципиальной важности: окисление сероводорода для серобактерий аналогично дыханию. Этот процесс обеспечивает их энергией, расходующейся на усвоение углерода из углекислоты. Таким образом было открыто явление, названное Виноградским «минеральным дыханием», или, по его терминологии 1922 г., аноргоксидацией. Сходные наблюдения были проведены и на железобактериях, для которых закись железа является энергетическим субстратом, окисление которого является для них источником энергии, используемой в процессах роста и развития.
Концепция хемоавтотрофного обмена веществ получила особенно убедительные доказательства и развитие в исследованиях Виноградского, посвященных возбудителям нитрификации — одного из важнейших почвенных процессов. Предположив, что в основе жизнедеятельности этих бактерий лежит процесс окисления аммиака (первая фаза нитрификации) и нитритов (вторая фаза нитрификации), Виноградский раскрыл особенности физиологии нитрифицирующих бактерий, длительное время ускользавшие от внимания его предшественников по изучению нитрификации — Р. Уорингтона, П. Франклэнда и др.
На среде, освобожденной от органических примесей (среда из кремнекислого геля), Виноградский выделил чистые культуры нитритных и нитратных бактерий. Путем точных количественных определений он доказал, что нитрифицирующие бактерии обладают способностью к хемосинтезу, т. е. к синтезу органических соединений за счет энергии химического окисления минеральных веществ.
В работах по физиологии хемоавтотрофных бактерий Виноградский развивал идею экологического подхода к изучению жизнедеятельности микробов в лабораторных условиях. Он неизменно подчеркивал, что только строгий учет экологических особенностей свободноживущих микроорганизмов позволяет раскрыть сущность их физиологии. Подобный подход помог ему выделить и изучить неизвестные до того формы микроорганизмов, обладающих своеобразной физиологией. Одним из них был Clostridium pasteurianum — анаэробный возбудитель азотфиксации (1893), и одновременно возбудитель маслянокислого брожения. Физиология аэробного азотфиксатора — азотобактера, выделенного в 1901 г. голландским микробиологом М. Вейеринком, была тщательно изучена позднее Виноградским с помощью метода элективных культур. Результаты исследований физиологии клубеньковых, а также целлюлозоразлагающих бактерий, возбудителей мочки льна и т. д., значительно обогатили общую и почвенную микробиологию. Впоследствии он разработал целостную теорию почвенной микробиологии.
Развитию общей и почвенной микробиологии значительно способствовали работы В.Л. Омелянского, посвященные вопросам разложения клетчатки в почве, физиологии возбудителей нитрификации и азотфиксации; исследования Н.Г. Холодного по физиологии железобактерий, а также по разработке методов исследований почвенных микроорганизмов; работы Г.А. Надсона по изучению физиологии светящихся и пигментных бактерий и по цитологии бактерий; труды Б.Л. Исаченко, развивавшего учение о геологической деятельности микробов. Работы этих ученых относятся уже к началу XX в.
Исследования М. Вейеринком физиологии клубеньковых бактерий, динамики процесса денитрификации и сульфатредукции, а также изучение дрожжевых ферментов, ферментов молочнокислых, уксуснокислых и бутиловых бактерий способствовали прогрессу общей и экологической микробиологии.
Созданный Вейеринком метод обогатительных культур, заключающийся в тщательном изучении условий развития микроорганизмов в природе, оказался ценным дополнением к методу элективных культур и получил широкое распространение в практике выделения специфичных в питании микробов.
В результате исследований экологических особенностей микроорганизмов в микробиологии сформировались такие научные понятия, как аэробиоз и анаэробиоз, автотрофность и гетеротрофность, паразитизм и сапрофитизм, симбиоз и антибиоз. Развитие этих понятий продолжалось в XX в.
Открытие Д.И. Ивановским фильтрующегося инфекционного начала.
История микробиологии XIX в. ознаменовалась еще одним важным событием. В 1892 г. Д.И. Ивановский обнаружил инфекционность сока растений табака, больного табачной мозаикой, сохраняющуюся при фильтровании сока через бактериальный фильтр Шамберлана. Это событие означало открытие нового инфекционного начала, являвшегося, по мнению Ивановского, мельчайшим микроорганизмом. В ходе исследований он обнаружил в клетках больных растений кристаллические включения. Заслуга Ивановского в том, что он смело связал существование этих кристаллов, получивших название кристаллов Ивановского, с болезнью растения.
Дмитрий Иосифович Ивановский. 1864–1920.
Сообщение Ивановского вызвало огромный интерес в научном мире. В 1898 г. Бейеринк повторил опыты Ивановского и подтвердил факт фильтруемости инфекционного начала, которому он дал название Contagium vivum fluidum. Позднее для определения этого фильтрующегося начала Бейеринк предложил термин «вирус». В том же году немецкие врачи Ф. Лефлер и П. Фрош сообщили, что животные, которым впрыскивали профильтрованную лимфу, взятую от больных ящуром животных, заболевали одновременно с получившими непрофильтрованную лимфу. Ученые сделали предположение, что либо профильтрованная лимфа содержит очень сильный токсин, либо, что более вероятно, чрезвычайно мелкий микроб. Таким образом, в микробиологии возникла новая, принципиально важная проблема, касающаяся природы фильтрующегося инфекционного начала. Ее детальное изучение относится уже к XX в.
Разработка и совершенствование методов микробиологических исследований.
Развитие научных представлений о микроорганизмах сопровождалось созданием новых принципов и методов микробиологических исследований.
Первые практические указания о способах культивирования микробов и защиты от внесения посторонней микрофлоры появились в ходе изучения проблемы самозарождения. Это — стерилизация питательных сред, путем кипячения, применение асбестовых и ватных пробок для закупоривания сосудов, способы химической и термической очистки вводимого в сосуды воздуха и т. д. Наиболее значительными в этом отношении были работы английского физика Д. Тиндаля, предложившего метод определения степени насыщенности воздуха микроорганизмами. Разрабатывая этот метод, Тиндаль опирался на работы Пастера.
В основе методов Тиндаля лежала способность мельчайших частиц и пылинок рассеивать луч света, который благодаря этому становится видимым — явление, получившее название «эффект Тиндаля». В 1869 г. он показал, что воздух становится «оптически пустым», т. е. стерильным, при его фильтровании через плотную ватную пробку. Он не вызывает загнивания питательных сред. В 1877 г. Тиндаль обнаружил, что терморезистентность одного и того же вида микробов изменяется в зависимости от стадии его развития. Исходя из этого положения, Тиндаль разработал метод фракционной стерилизации сред, заключающийся в их периодическом прогревании. Этот метод, названный тиндализацией, нашел затем широкое применение в микробиологии.
Значительное совершенствование методов микробиологических исследований произошло в ходе изучения этиологии инфекционных болезней. Попытки определения специфических возбудителей и изучения их особенностей способствовали созданию разнообразных методов культивирования микробов, среди которых наиболее важными оказались методы выделения чистых культур.
Впервые на принципиальную возможность выделения болезнетворных микробов и «инфузорий» в чистые культуры указал в 1840 г. Я. Генле. Среди огромного числа разнообразных методов, созданных учеными в XIX в., наиболее практически ценными оказались следующие.
В 1869 г. Г. Гоффман впервые ввел в практику культивирование микробов на ломтиках картофеля. Этот способ, давший возможность получать колонии микробов отдельных видов, был с успехом использован Д. Шретером (1870) для культивирования пигментных форм, что позволило провести видовую дифференциацию среди различных форм бактерий. Попытка Шретера использовать пигментообразование в качестве отличительного признака может рассматриваться как первый факт применения культуральных или физиологических признаков для дифференциации видов.
В 1876 г. К. Виттандини, а вслед за ним Э. Клебс и О. Брефельд разработали метод использования желатины в качестве плотной питательной среды. Этот метод наряду с методом выращивания микробов на агар-агаре, который в 1883 г. ввела в практику А. Хессе, положил начало широкому применению плотных прозрачных естественных питательных сред для культивирования микробов.
Клетки листьев табака, пораженные табачной мозаикой. В клетках видны кристаллы вируса. По Д.И. Ивановскому. 1892.
Изготовление жидких питательных сред, сначала синтетических, было начато в 1858 г. Пастером в его исследованиях молочнокислого брожения. Изобретение методов стерилизации открыло возможность использования жидких естественных питательных сред. Изготовление Пастером мясного бульона с добавлением в него пептона (МПБ) положило начало широкому применению жидких культуральных сред. Оно послужило основой для создания (Л. Пастер) и дальнейшего совершенствования (Э. Клебс, Г. Галлир, Дж. Листер) метода разведения, широко вошедшего в практику выделения чистых культур.
Как уже упоминалось, наиболее ценный вклад в развитие техники микробиологических исследований внесли Р. Кох и его школа. В 1882 г. Кох соединил преимущества непрозрачных плотных сред (пространственное расположение колоний) и прозрачных жидких сред в едином методе плотных прозрачных сред. Введением этого метода был создан простейший способ получения чистых культур микробов. Изготовление других плотных сред по принципу Коха — МПЖ (мясопептонная желатина) и МПА (мясопентонный агар) в совокупности с изобретением Г. Гаффки и Ф. Лефлера — культивирование микробов на предметном стекле (или в чашках Петри) — имело огромное значение для всего развития микробиологии. Столь же перспективным оказался и созданный в 1887–1890 гг. С.Н. Виноградским метод элективных культур и метод обогатительных культур Бейеринка (1890).
Большое значение для прогресса микробиологии имела также разработка методов окрашивания и фиксации микробов. Они совершенствовались параллельно с развитием этих методов в гистологии, цитохимии и т. д. Так, способ избирательного обесцвечивания окрашенных тканей спиртом, введенный в 1869 г. гистологом А. Беттчером, нашел широкое применение и в микробиологии.
Дифференцированное окрашивание различных форм микробов стало применяться после исследований К. Вейгерта, которому в 1871 г. удалось окрасить кокковидные зооглеи аммиачным кармином, а также с работ Эберта, который в 1872 г. окрашивал кокки гематоксилином. В 1875 г. Вейгерт впервые разработал метод окрашивания бактерий анилиновыми красками. С тех пор этот метод широко применяется в микробиологии.
На основе учета избирательной восприимчивости микробов к основным анилиновым краскам и невосприимчивости к кислым анилиновым краскам П. Эрлих предложил в 1886 г. использовать феномен окрашивания не только для их дифференцированного окрашивания, но и в качестве реактива на самое присутствие микробов.
Принципиальное значение получил метод окрашивания микробов, разработанный в 1884 г. X. Грамом. Сущность его состояла в выделении промежуточного состояния окрашивания между максимальным окрашиванием (генцианвиолетом) и обеспечиванием препарата под действием сначала йода (раствор люголя), а затем спирта с последующей дополнительной окраской (везувином). Микробы, воспринимающие дополнительное окрашивание, стали считаться грамотрицательными, неокрашивающиеся везувином и сохраняющие первое окрашивание (генцианвиолетом) грамположительными. Отношение микробов к окрашиванию по Граму является постоянным признаком и широко применяется как систематический признак.
* * *
Таким образом, важнейшими достижениями микробиологии, позволившими ей во второй половине XIX в. выделиться в самостоятельную дисциплину, явились: создание экспериментального метода изучения жизнедеятельности микробов (Пастер), развитие физиологического (Пастер) и экологического (Виноградский) направлений, раскрытие этиологии важнейших инфекционных заболеваний (Пастер, Кох), создание важнейших методов микробиологических исследований (Пастер, Кох, Виноградский и др.), раскрытие микробиологической сущности многих природных процессов (Виноградский, Бейеринк), открытие мира вирусов (Ивановский Бейеринк) и т. д. Исследования жизнедеятельности микробов выявили не только огромное разнообразие сфер обитания микробов в природе и специфичность их воздействия на субстрат, но и различные формы взаимоотношения друг с другом. Результаты этих исследований послужили предпосылкой для глубокого изучения сущности микробиологических процессов, метаболизма их возбудителей, внутреннего механизма осуществления химических преобразований веществ, совершающихся при участии микробов.