Открытие роли ДНК

Тогда же, когда Томас Морган решал проблему роли генов в передаче наследственной информации, ученые проводили эксперименты в, казалось бы, абсолютно не связанной с генетикой области науки, занимаясь разработкой методов, которые в итоге помогли пролить свет на молекулярный механизм наследственности. Эта глава, помимо прочего, рассказ о том, как новое научное открытие может быстро найти экспериментальное применение и открыть путь ко множеству других открытий.

Рентгеновские лучи были открыты в 1895 г., но поначалу их природа оставалась загадкой. Никто точно не знал, состоят ли они из потока частиц, наподобие электронов, или из электромагнитных волн, как свет, но с гораздо более короткой длиной волны. Важный прорыв произошел в 1912 г., когда группа ученых под руководством Макса фон Лауэ (1879–1960) из Мюнхенского университета открыла дифракцию рентгеновских лучей при прохождении их сквозь кристаллы. Когда свет пропускается через две узкие щели на экране, его волны по другую сторону экрана образуют череду светлых и темных полос, интерференционный узор. Фон Лауэ выяснил, что атомы кристалла сульфида цинка находятся на нужном расстоянии, чтобы обеспечить «щели» подходящего размера для создания сходного эффекта при прохождении рентгеновских лучей. Проведя эксперимент, его команда обнаружила очень сложную дифракционную картину, которую было трудно объяснить, но она явно свидетельствовала о волновой природе рентгеновского излучения. На фотопластинке проявилось множество отдельных пятен, которые были организованы в виде пересекающихся друг с другом кругов, расположенных вокруг центрального пятна от основного луча. В 1914 г. фон Лауэ получил Нобелевскую премию по физике «за открытие дифракции рентгеновских лучей на кристаллах». Тем временем другая команда ученых уже значительно приблизилась к пониманию подробностей этого процесса.

К тому моменту Уильям Генри Брэгг (1862–1942) был всеми уважаемым физиком и работал в Лидском университете. Его сын Уильям Лоуренс Брэгг (1890–1971; его всегда называли Лоуренс) был физиком начинающим и работал в Кембридже. Поначалу Уильям попытался объяснить полученную немецкими коллегами дифракционную картину, считая свет потоком частиц, но вскоре убедился, что она имеет волновое происхождение. Отец с сыном обсудили значение этого открытия и пришли к выводу, что, скорее всего, можно спланировать эксперимент в обратном порядке и определить строение самого кристалла, проанализировав расположения темных и светлых пятен на дифракционной картине. Лоуренс разработал ряд правил, которые определяли местоположение темных и светлых пятен, когда пучок рентгеновских лучей с определенной длиной волны проходил через кристалл с определенным расстоянием между атомами. Это стало называться законом Брэгга. Закон работал в обоих направлениях. Если вы знаете расположение атомов в кристалле, то можете использовать дифракцию для измерения длины волны рентгеновских лучей. Если же вам известна длина волны, то вы можете использовать дифракцию, чтобы определить расположение атомов в кристалле. Лоуренс применил свой закон для интерпретации дифракционных картин, полученных в Мюнхене, но для детальных расчетов ему не хватало информации о длине волны рентгеновских лучей, которые его коллеги использовали в ходе экспериментов. Поэтому Уильям провел собственные опыты и изобрел первый рентгеновский спектрометр, прибор для точного измерения длины волны рентгеновских лучей. К данным этих экспериментов был применен закона Брэгга. Как только было точно доказано, что рентгеновские лучи ведут себя как волны, их можно было использовать для анализа строения кристаллов, и именно поэтому они важны для истории изучения ДНК.

Повести анализ такой сложной структуры, как ДНК, состоящей из множества различных типов атомов, чрезвычайно трудно. Но с менее сложными кристаллами работать проще, и вскоре с помощью этого метода было, например, установлено, что кристаллы хлорида натрия (пищевой соли, NaCl) состоят не из отдельных молекул NaCl, но из трехмерной решетки атомов натрия (Na) и хлора (Cl), регулярно чередующихся друг с другом. Свои исследования Брэгги описали в книге «Рентгеновские лучи и строение кристаллов» (X-rays and Crystal Structure), изданной в 1915 г., когда Лоуренс служил в британской армии во Франции. В том же году они с отцом получили Нобелевскую премию по физике «за заслуги в исследовании кристаллов с помощью рентгеновских лучей». На тот момент Лоуренсу было всего 25 лет, и он стал самым молодым нобелевским лауреатом по физике за всю историю премии. В своей нобелевской лекции он сказал:

Изучение кристаллической структуры с помощью рентгеновских лучей впервые дало нам представление о подлинной организации атомов в твердых телах… Кажется, вряд ли есть такой тип материи, находящейся в состоянии твердого тела, который бы мы не могли попытаться проанализировать с помощью рентгеновского излучения. Нам впервые стало известно точное расположение атомов в твердых телах; мы можем увидеть, на каком расстоянии друг от друга расположены эти атомы и как они сгруппированы.

Именно благодаря этому открытию несколько десятков лет спустя будет изучено строение белков и ДНК. Но сперва надо было установить центральную роль ДНК в процессе наследования признаков, а это начало происходить только в конце 1920-х гг.

Следующим шагом стали эксперименты, которые опять позволили наблюдать за более быстрыми изменениями. Горох Менделя давал только одно поколение в год, что ограничивало его полезность в изучении наследственности. Дрозофилы Моргана давали потомство каждые две недели. В 1928 г. Фредерик Гриффит (1879–1941), английский врач, работавший на Министерство здравоохранения Великобритании в Лондоне, начал работать с бактериями, изменения в которых ученые могли наблюдать в пределах нескольких часов; это также позволило биологам приблизиться к пониманию того, какие молекулы играют ключевую роль в механизме наследственности. Гриффита в первую очередь интересовала не наследственность; он изучал бактерии как возбудителей болезней, а не как модельный объект в области генетики. Но параллельно он сделал открытие, которое оказалось важнейшим для понимания эволюции.

Эпидемия испанки 1918–1920 гг. унесла жизни порядка 50 млн человек — больше, чем погибло на полях сражений Первой мировой войны. После нее правительства многих стран расширили свои программы по исследованию инфекционных заболеваний. Гриффит сконцентрировался на изучении пневмококков (это группа бактерий, вызывающих пневмонию), чтобы разработать вакцину от пневмонии. В начале 1920-х гг. он начал работать с двумя штаммами пневмококков, которые оказывали очень разное воздействие на мышей. Бактерии одного штамма были покрыты гладкой оболочкой из полисахарида, которая придавала их культуре глянцевый вид. Этот штамм назвали «гладким» или S (от англ. smooth). У другого штамма не было такой оболочки, и его колонии выглядели шероховатыми и морщинистыми. Этот штамм назвали «морщинистым» или R (от англ. rough). Штамм S очень активен и вызывает тяжелую форму инфекции, а штамм R малоактивен и вызывает лишь легкое протекание болезни (существует еще третий штамм пневмококков, но Гриффит его не использовал). До Гриффита бактериологи считали, что каждый из трех штаммов пневмококков абсолютно автономен и обладает свойствами, которые не меняются из поколения в поколение. Гриффит знал, что в теле человека (или мыши), пораженном пневмонией, могут одновременно присутствовать разные — смертельные и не смертельные — штаммы пневмококков, и провел эксперименты, чтобы выяснить, как это может повлиять на перспективы разработки вакцины.

Когда организм заражается морщинистым штаммом пневмококка, иммунная система легко распознает бактерии как захватчиков и уничтожает их, прежде чем они успевают причинить серьезный вред. Оболочка гладкого штамма действует как камуфляж, который прячет бактерии от иммунной системы, поэтому они беспрепятственно размножаются и провоцируют тяжелое заболевание и даже смерть. Гриффит продемонстрировал, что зараженные морщинистым штаммом мыши выживали, а мыши, зараженные гладким, погибали. Затем он ввел мышам бактерии штамма S, которые были убиты при помощи тепловой обработки. Мыши выжили, но после этого Гриффит получил поразительный результат, о котором он сообщил в январе 1928 г.

В следующей серии экспериментов Гриффит смешал безвредные мертвые гладкие бактерии с безвредными живыми морщинистыми бактериями и ввел их мышам. Все мыши погибли. Ни одна из этих форм бактерий не могла убить организм, но их смесь оказалась смертельной. Когда он извлек образцы тканей из мертвых мышей, он обнаружил, что они кишат живыми гладкими пневмококками. По выражению Гриффита, живые морщинистые бактерии «трансформировались» в живые гладкие бактерии. Он объяснил это тем, что некий трансформирующий фактор — сегодня мы называем его генетическим материалом — передался от мертвых гладких бактерий живым морщинистым бактериям, за счет чего они «научились» синтезировать гладкую оболочку. В ходе дальнейших экспериментов бактерии после трансформации в мышах переносились в лабораторную посуду; «новые» гладкие бактерии размножались там и образовывали культуру гладких бактерий, несмотря на то, что являлись потомками трансформированных морщинистых бактерий. Как Гриффит писал в статье, в которой он объявил об этом открытии, «штамм R… превратился в штамм S». Но Гриффит не знал, за счет каких молекул происходило это превращение. Это выяснилось только в 1944 г. в результате новых экспериментов, которые провели ученые, вдохновленные наблюдениями Гриффита. К тому времени кристаллография уже начала рассказывать о строении важных биологических молекул.

В 1930-е гг. все еще считалось, что носителями наследственной информации являются белки, и они стали первыми биомолекулами, которые исследовали при помощи рентгеновской кристаллографии. Кристаллография в итоге показала, что ключевой особенностью этих длинных цепочек из аминокислот является то, каким образом они сворачиваются в сложные трехмерные структуры, которые определяют их биологические свойства.

Первые шаги в этом направлении сделали Джон Бернал (1901–1971) и его коллеги по Кембриджу в 1934 г. Бернал, который в 1920-х гг. работал с Уильямом Брэггом, начал с применения рентгеновской кристаллографии для определения строения графита и бронзы. Но когда он попытался применить эти методы для исследования органических молекул, он столкнулся с проблемой. Кристаллы в основном выращивают в концентрированном растворе, известном как «насыщенный». Кристаллы растут по мере испарения жидкости — как в простых школьных опытах с применением обычной поваренной соли (хлорида натрия) или сульфата меди. Отдельные молекулы или атомы выстраиваются в повторяющиеся ряды «элементарных ячеек» определенного типа, образуя кристаллическую решетку. Исследователи рассчитывали, что смогут получить кристаллы белка таким же способом, позволив очищенному белку выпасть из насыщенного белкового раствора. Но когда белки высушивали, перед тем как подвергнуть рентгеновскому облучению, их структура рассыпалась как карточный домик.

В середине 1930-х гг. оксфордский биохимик Джон Филпот, работавший в то время в Уппсале в Швеции, пытался вырастить кристаллы белка пепсина (пепсин — это пищеварительный фермент, который расщепляет белки в нашей пище). Он приготовил насыщенный раствор с кристаллами, поставил емкость в холодильник в своей лаборатории и уехал отдыхать на лыжный курорт. По возвращении он обнаружил, что его кристаллы очень выросли — некоторые до 2 мм в длину. По чистой случайности лабораторию Филпота тогда же навестил Глен Милликен из Кембриджа, который, по легенде, взглянув на получившийся препарат, сказал: «Я знаю человека, который душу продаст за эти кристаллы». Филпот вырастил их с избытком и великодушно отдал Милликену часть кристаллов прямо в пробирке с насыщенным раствором, чтобы тот отвез ее Берналу в Кавендишскую лабораторию.

В то время Бернал сотрудничал с приглашенной исследовательницей из Оксфорда Дороти Кроуфут (1910–1994), которая позже вышла замуж и стала известна как Дороти Ходжкин. Бернал обнаружил, что влажные свежие кристаллы при облучении поляризованным светом обнаруживают свойство, известное как двойное лучепреломление, что свидетельствует об их упорядоченной кристаллической структуре. Бернал и Кроуфут запечатали подаренные Филпотом кристаллы вместе с раствором в тонкостенной стеклянной трубке (капилляре) и затем облучили их рентгеновскими лучами. Так в 1934 г. был получен первый снимок дифракции рентгеновских лучей на одиночных кристаллах пепсина. Метод герметичных капилляров Бернала оставался стандартным способом рентгенографических исследований крупных биомолекул на протяжении следующих 50 лет.

С самого начала было ясно, что такие снимки в принципе могут пролить свет на структуру самих белковых молекул. Когда Бернал и Кроуфут описывали свой эксперимент в журнале Nature, они отметили:

Теперь, когда получены рентгеновские снимки кристаллов белка, понятно, что у нас есть новый инструмент для их исследования. Изучив структуру всех кристаллических белков, мы сможем прийти к гораздо более детальным выводам о строении белка, чем это позволяли сделать прежние физические или химические методы.

На протяжении следующих двух десятилетий Дороти Ходжкин продолжала изучать важные биологические молекулы методом рентгеновской кристаллографии, за что в 1964 г. ей была присуждена Нобелевская премия по химии. В результате многочисленных исследований ряда ученых выяснилось, насколько сложной структурой обладают эти молекулы жизни. Последовательность аминокислот в цепочке является только первичной структурой белка. Эти цепочки могут закручиваться в мотивы вроде спирали, которые являются вторичной структурой. А спирали и другие мотивы вторичной структуры могут образовывать своего рода трехмерный клубок — третичную структуру. Роль белков в биологических процессах определяется не только их химическим составом, но и конкретной формой этого трехмерного клубка, однако установить эту форму до появления высокоскоростных компьютеров было чрезвычайно сложной и трудоемкой задачей. До 1971 г. ученым удалось полностью определить трехмерное строение всего лишь семи белков; сегодня их число превысило 30 000. Тем не менее в 1944 г., когда было установлено, что «трансформирующий фактор» Фредерика Гриффита — это ДНК, молодая наука биомолекулярная кристаллография была почти готова принять следующий вызов.

После того как в 1928 г. были опубликованы результаты опытов Гриффита, другие исследователи попытались выяснить, чем является то, что передается от одного штамма бактерий к другому. Ключевую роль в этих исследованиях сыграл Освальд Эвери (1877–1955), возглавлявший группу ученых в Рокфеллеровском институте в Нью-Йорке. Эвери изучал пневмонию с 1913 г. и поначалу скептически отнесся к открытию Гриффита, которое на первый взгляд противоречило результатам исследований его коллег по определению различных штаммов пневмококков. Но его собственные эксперименты и эксперименты других групп вскоре подтвердили открытие Гриффита и обозначили новое направление поисков.

В 1931 г. группа Эвери обнаружила, что процесс трансформации может происходить даже без участия мышей. Выращивая пневмококки R в чашках Петри (это стандартный плоский лабораторный сосуд), в которых также находились мертвые пневмококки S, ученые смогли превратить живые пневмококки R в живые пневмококки S. Чтобы определить трансформирующий агент, они сначала последовательно замораживали и нагревали колонии бактерий типа S, чтобы разрушить клетки и получить жидкость, в которой их внутреннее содержимое было смешано с фрагментами их оболочек. Эти фрагменты отделили при помощи вращения пробирок со смесью на центрифуге: плотные фрагменты оболочек оседали на дно, а жидкость с внутренним содержимым оставалась наверху. Этой жидкости оказалось достаточно, чтобы трансформировать пневмококки R в пневмококки S.

Выяснение всех этих подробностей заняло немало времени, но к 1935 г. это было сделано. К следующему этапу исследований Эвери привлек еще двух исследователей — сначала уроженца Канады Колина Маклауда (1909–1972), а затем Маклина Маккарти (1911–2005), чтобы они помогли ему тщательно изучить трансформирующую жидкость. На завершение этой работы у них ушло почти десять лет: они по одному выявляли отдельные компоненты клетки, которые не отвечали за трансформацию, пока у них не остался всего один подозреваемый.

Первым кандидатом на роль трансформирующего агента был белок. Поэтому исследователи добавили в полученную из S-бактерий жидкость протеазу — фермент, который расщепляет молекулы белка на составляющие. Но жидкость все равно не утратила свои трансформирующие свойства. Затем они рассмотрели возможность того, что процесс изменения связан с гладкой оболочкой бактерий, состоящей из полисахаридов. Они проверили это предположение, применив другой фермент, который расщеплял полисахариды, но это тоже никак не повлияло на происходящее. Тогда им пришлось при помощи долгой череды химических процессов удалить все следы белков и полисахаридов, а потом провести тщательный химический анализ того, что осталось. Этот анализ показал, что, судя по соотношению углерода, водорода, азота и фосфора, в растворе оставалась нуклеиновая кислота. Последняя серия экспериментов показала, что это ДНК, а не РНК.

Результаты этого открытия были опубликованы в 1944 г., после чего не осталось никаких сомнений, что трансформирующим агентом является ДНК. В своей статье команда Эвери не заявила, что ДНК является тем материалом, из которого состоят гены, но Эвери упоминал об этом в частных беседах, в том числе в письме своему брату Рою, который был бактериологом. Однако идея, что не белок, а ДНК несет наследственную информацию, была настолько шокирующей, что она далеко не сразу получила широкое признание среди биологов. Большинство из них по-прежнему были убеждены, что молекула ДНК слишком проста, чтобы выполнять эту функцию; по мнению многих, скоропалительно было утверждать, что ДНК является активным участником настоящих генетических процессов, только исходя из того, что ДНК отвечает за трансформацию клеток. К тому же новости в то время распространялись достаточно медленно, в том числе и потому, что шла Вторая мировая война. Но, несмотря на сомнения мирового научного сообщества, исследования Эвери, Маклауда и Маккарти вдохновили американских биохимиков продолжить работу в этом направлении. Так появилась наука молекулярная генетика. Но прошло еще несколько лет, прежде чем накопилось достаточно информации о генетическом материале и чаша весов окончательно склонилась в пользу ДНК благодаря другому блестящему эксперименту. Тем временем еще одним из главных героев рассказа о ДНК был разработан новый метод исследования биомолекул.

Эта новая идея была детищем американского химика Лайнуса Полинга (1901–1994), и она пришла ему в голову в 1948 г., когда он изучал дифракционные картины, которые возникали при рентгеновском облучении кристаллов определенных белков.

Мы уже упоминали один тип белков — глобулярные молекулы, которые выполняют всю работу в организме, — вроде белка гемоглобина, который переносит кислород в крови. Но существуют и другие белки, тоже состоящие из длинных цепочек, которые называются полипептидами. В таких фибриллярных белках молекулы не сворачиваются в клубки, а в основном выглядят как тонкая вытянутая цепочка. Они являются важными строительными материалами организма — из них, например, состоят волосы, перья, мышцы, шелковые волокна и рога.

Первые снимки рентгеновской дифракции на фибриллярном белке были получены в 1930-х гг. Уильямом Астбери (1898–1961) из Лидского университета. Этот ученик Уильяма Брэгга изучал кератин — компонент шерсти, волос и ногтей. Снимки были недостаточно четкими для того, чтобы можно было определить точное строение кератина, но на них был виден повторяющийся мотив, из чего было понятно, что строение этого белка является простым. На самом деле он обнаружил два мотива: первый, в ненатянутых волокнах, Астбери назвал альфа-формой; второй, в натянутых волокнах, он назвал бета-формой.

Лайнус Полинг первым вывел правила квантовой химии и подробно описал их в своей эпохальной книге. Его очень интриговала возможность использовать свои познания в химии для определения строения биомолекул, и он позже вспоминал, как «потратил все лето 1937 года на поиски способа скрутить полипептидную цепь в трех измерениях в соответствии с данными, полученными Астбери в ходе экспериментов с рентгеновским излучением». Сначала он хотел решить эту задачу, выяснив, могут ли атомы за счет своих квантовых свойств сцеплять между собой компоненты молекулы, но эта попытка окончилась неудачей, и поэтому он решил начать с основ и изучить строение аминокислот, которые являются звеньями полипептидной цепи, прежде чем определить, как они укладываются одна к другой. Но это был не единственный проект, которым он занимался в 1940-е гг.; как многим ученым, ему помешала Вторая мировая война, и он завершил его очень нескоро.

Он начал с изучения снимков рентгеновской дифракции отдельных аминокислот. Полинг работал в Калифорнийском технологическом институте вместе с Робертом Кори (1897–1971), и ему очень пригодились познания Кори в области квантовой физики. Многие химические связи позволяют прокручиваться атомам или химическим группам по обе стороны от этой связи. Но Полинг и Кори обнаружили, что пептидная связь между углеродом и азотом (отсюда и название «полипептиды») зафиксирована из-за квантового явления, которое называется «резонанс». Звенья цепочки не могут вращаться вокруг таких связей, и поэтому отдельные части цепочки жестко зафиксированы. Это ограничивает способность всей цепочки изгибаться и сворачиваться. Она состоит из двух гибких звеньев, затем одного жесткого, затем опять двух гибких, затем еще одного жесткого и т.д. Но Полинг все равно не мог придумать, как сложить цепочку так, чтобы она соответствовала фотографиям Астбери, и поэтому отложил эту головоломку в сторону до тех пор, пока в 1948 г. на него не снизошло озарение.

В 1948 г., хотя его основным местом работы являлся Калифорнийский технический институт, Полинг отправился в Англию, в Оксфордский университет. Весной он сильно простудился и был прикован к постели и, когда ему наскучило читать фантастику и детективы, он решил предпринять еще одну попытку определить строение кератина.

Не имея под рукой практически никаких инструментов, Полинг просто нарисовал длинную полипептидную цепочку на длинной полоске бумаги. Он помнил расстояния между ее компонентами и углы, под которыми они располагались относительно друг друга. Но оказалось, что цепочку с этими параметрами невозможно воспроизвести на прямом и плоском листе бумаги. Одно конкретное звено, которое снова и снова повторялось в разных местах на протяжении всей цепи, всегда выглядело неправильно. Положение этого звена, которое должно было располагаться под углом 110 градусов, нельзя было изменить, потому что оно было зафиксировано квантовым резонансом между атомами углерода и азота. Чтобы соответствовать этому углу, цепочка не могла быть прямой. Тогда Полинга озарило, и он смял полоску бумаги, согнув ее в тех местах, где находились эти ключевые звенья, чтобы получить верный угол в 110 градусов. Согнутая полоска бумаги теперь стала похожа на штопор с повторяющимися звеньями, которые располагались в пространстве подобно спирали. Более того, верные углы позволили азотно-водородной группе одной пептидной связи оказаться рядом с атомом кислорода, прикрепленным к углероду, который располагался в цепочке на четыре звена дальше. И так происходило по всей длине цепочки. Атомы кислорода и водорода обладают определенным сродством, вызванным квантовыми эффектами, и притягиваются друг к другу посредством так называемой водородной связи. Эти водородные связи помогают зафиксировать спиралевидную структуру, которую обнаружил Полинг.

После возвращения Полинга в США его команда с помощью рентгеновской дифракции провела дальнейшие исследования, которые подтвердили, что в основе структуры волоса лежит такая однонитевая спираль. Проделав колоссальную работу, Полинг и его коллеги опубликовали в 1951 г. семь научных статей, в которых строение волос, перьев, мышц, шелковых волокон, рогов и других фибриллярных белков было описано с применением того, что Полинг, позаимствовав терминологию Астбери, назвал альфа-спиралью. Но все эти детали менее важны по сравнению с тем, как именно был сделан этот прорыв. Открытие Полинга заставило ученых задуматься о спиралях в контексте биологических молекул, а также продемонстрировало возможности анализа по принципу «от малого к большому», когда создатели моделей могли путем подбора сочетаний простейших строительных блоков биологического материала найти комбинации, соответствующие данным рентгеноструктурного анализа. Всего два года спустя этот подход позволил сорвать главный приз в истории молекулярной биологии — установить структуру ДНК.

Даже в конце 1940-х гг., несмотря на работы Освальда Эвери и его коллег, по-прежнему часто считалось, что носителями генетической информации являются белки, а не ДНК. Но затем были проведены эксперименты, которые убедили даже отъявленных скептиков в том, что ДНК и есть «та самая» молекула жизни.

Почва была подготовлена благодаря анализу ДНК, который провел Эрвин Чаргафф (1905–2002), биохимик австрийского происхождения из Колумбийского университета в США. Под впечатлением от работ Эвери, Маклауда и Маккарти во второй половине 1940-х гг. он сосредоточил усилия своей лаборатории на исследовании ДНК. В молекулах ДНК и РНК содержатся два типа оснований. Первый из них — «пиримидины» — представляет собой единственное кольцо из шести атомов в форме практически правильного шестиугольника, которое может прикрепляться к другим частям молекулы с внешней стороны кольца. К этому типу относятся урацил (У), тимин (T) и цитозин (Ц). Второй тип называется «пурины» и обладает более сложным строением из двух похожих колец, соединенных друг с другом одной из сторон (что-то наподобие восьмерки). К этому семейству относятся аденин (A) и гуанин (Г). В ДНК содержатся основания А, Т, Г, Ц; в РНК — А, У, Г, Ц. Проведя серию точных экспериментов, команда Чаргаффа вывела набор простых правил, определяющих количественные соотношения между видами оснований в молекулах ДНК. Эти правила были изложены в статье 1950 г.: общее количество пуринов в образце ДНК (A + Г) всегда равно общему количеству пиримидинов (T + Ц); кроме того, количество А почти равно количеству Т, а количество Г почти равно количеству Ц. Команда также обнаружила, что соотношение гуанина, цитозина, аденина и тимина у разных живых видов различно. Все это означало, что молекула ДНК не является просто каркасом с бесконечным повторением четырех оснований и должна иметь более сложное строение; это была смерть (совсем не преждевременная) тетрануклеотидной гипотезы. «Правила Чаргаффа» дали исследователям один из ключей к пониманию того, как устроена молекула ДНК, но это понимание пришло только после того, как другая команда убедительно доказала, что генетическая информация содержится именно в ДНК.

К пониманию значения ДНК привел ряд экспериментов, которые проводились со все более мелкими и быстро воспроизводящимся организмами. Грегор Мендель работал с горохом, Томас Хант Морган — с плодовыми мушками, а команда Эвери — с бактериями. Последний шаг на этом пути был сделан благодаря самым крошечным носителями генетического материала — вирусам. Чем меньше организм, тем меньше в нем чего-то, кроме генетического материала, и тем проще изучать этот материал. В вирусах это соотношение выражено в крайней степени.

Вирусы представляют собой просто наполненные генетическим материалом белковые капсулы размером гораздо меньше бактерий. Впервые их сфотографировали в 1940-х гг. с помощью электронного микроскопа. Типичный вирус напоминает головастика с «головой» в виде капсулы, заполненной генетическим материалом, и «хвостиком», который используется для прикрепления. Когда вирус атакует клетку, он проделывает в ее стенке отверстие и впрыскивает внутрь свой генетический материал, а пустая капсула, или оболочка, остается прикрепленной к стенке клетки. Впрыснутое вещество захватывает химическую фабрику клетки, и ее внутренние ресурсы используются для производства копий вируса. Затем клетка лопается, высвобождая новые копии вируса, и процесс повторяется.

Это простейшая форма жизни: вирусы существуют только для того, чтобы воспроизводить самих себя. В начале 1950-х гг. Альфред Херши (1908–1997) и Марта Чейз (1927–2003) из лаборатории Колд-Спринг-Харбор в США провели с вирусами замечательный эксперимент, благодаря которому было получено окончательное доказательство того факта, что именно ДНК содержит инструкции по производству копий вируса в атакованной клетке.

Вирусы, с которыми они работали, называются «бактериофаги» (или для краткости просто «фаги», от древнегреческого «фагеин», «пожираю»), так как они «пожирают» бактерии. В основе эксперимента Херши и Чейз лежал простой факт, что фосфор содержится в ДНК, но отсутствует в белках, а сера содержится в белках, но отсутствует в ДНК. Изотопы как фосфора, так и серы легко получить (если, конечно, вы ученый) в радиоактивной форме. Херши и Чейз «скормили» фагам бактерии, которые выращивались в питательной среде с содержанием радиоактивного изотопа либо фосфора (фосфор-32), либо серы (сера-35). Затем полученным радиоактивным фагам дали возможность атаковать колонию нерадиоактивных бактерий. Везде, где ученые обнаруживали радиоактивный фосфор, они прослеживали путь ДНК, а везде, где они обнаруживали радиоактивную серу, они прослеживали путь белка.

К сожалению, после того, как радиоактивные фаги заразили культуру бактерий, исследователи получили массу клеток, до отказа забитых новыми вирусами, но с прикрепленными на их стенках пустыми капсулами фагов, в которых прежде содержался их генетический материал. Оба вида радиоактивных изотопов присутствовали в клеточном бульоне. Чтобы отделить оболочки старых фагов от новых вирусов, которые производились внутри бактерий, ученые использовали обычный кухонный прибор, блендер фирмы Waring; биологам следующих поколений это исследование известно под названием «эксперимент с блендером Waring».

Херши и Чейз использовали блендер на минимальной мощности, чтобы аккуратно отделить оболочки фагов от стенок инфицированных клеток. Затем они поместили бульон в центрифугу, так что бактерии, заполненные новыми вирусами, осели на дно, а оболочки старых фагов остались плавать в растворе. Затем осадок и раствор были проанализированы. Радиоактивные изотопы фосфора, указывающие на присутствие ДНК, были обнаружены внутри клеток (в новом поколении вирусов), а радиоактивные изотопы серы, указывающие на присутствие белка, — в пустых оболочках. Результаты эксперимента были опубликованы в 1952 г. и не оставили места для сомнений: генетическая информация содержится именно в ДНК, а белки являются строительным материалом для живых организмов.

Этот на первый взгляд простой эксперимент был в значительной мере обязан своим успехом навыкам Марты Чейз, хотя официально она была «всего лишь» помощницей Альфреда Херши. Вацлав Шибальски, другой биолог из лаборатории Колд-Спринг-Харбор, позже вспоминал:

Ее вклад в экспериментальную часть был очень велик. Лаборатория Херши была совершенно необычной. В то время они работали только вдвоем: когда вы входили в лабораторию, там царила абсолютная тишина, а Альфред руководил экспериментами, просто указывая Марте пальцем, и почти ничего не говоря. Она идеально подходила для работы с Херши.

С этого момента стало ясно, что белки были строительным материалом бактериофагов, а ДНК — носителем генетической информации. Теперь едва ли хоть один биолог считал, что генетический материал является чем-то иным, кроме ДНК, и все было готово для установления строения самой молекулы ДНК.

Несмотря на то что Херши и Чейз проводили свои эксперименты в США, к открытию структуры ДНК вплотную подошли английские ученые. Впервые основы ее строения стали яснее благодаря экспериментам группы ученых из лаборатории биофизики лондонского Королевского колледжа, хотя в то время по странной прихоти судьбы их заслуги не были признаны. Руководитель этого подразделения Джон Рэндалл (1905–1984) стал одним из первых, кто признал ДНК носителем генетической информации; он был физиком, который в начале карьеры занимался рентгеновской дифракцией под руководством Лоуренса Брэгга, и потому собрал нетипичную для той эпохи группу ученых, в которой вместе с физиками трудились биологи, биохимики и представители других дисциплин.

В 1950 г. уроженец Новой Зеландии Морис Уилкинс (1916–2004) изучал в лаборатории Рэндалла различные виды биологических молекул, включая ДНК, белки и витамин B12. В мае того же года в Лондон прибыл швейцарский биохимик Рудольф Зигнер (1903–1990), чтобы выступить на собрании Фарадеевского общества с докладом об успешных экспериментах по выделению нуклеиновых кислот из вилочковой железы (тимуса) телят, которые он провел совместно со своим учеником Гансом Швандером. Зигнер передал Уилкинсу образец выделенной им крайне чистой ДНК. На самом деле это не было неожиданностью, так как Зигнер работал с ДНК уже много лет и еще в 1938 г. сообщал в статье в журнале Nature, что то, что он тогда назвал тимонуклеиновой кислотой, должно представлять собой длинную нитевидную молекулу массой от 500 000 до 1 000 000 атомных единиц. Но, как и в случае со многими другими «фундаментальными» исследованиями, их развитие и распространение информации о них задержала Вторая мировая война. Образцы ДНК, с которым начал работать Уилкинс, по консистенции представляли собой гель, и, когда он готовил их для анализа в ультрафиолетовом свете, он заметил кое-то любопытное. Вот как он рассказывал об этом в своей нобелевской лекции:

Каждый раз, когда я касался геля стеклянной палочкой и затем отводил палочку, вслед за ней вытягивалось тонкое, почти невидимое волокно ДНК, похожее на нить паутины. Совершенство и однородность этих волокон указывали на то, что молекулы в них расположены упорядоченным образом. Я сразу подумал, что эти волокна могут быть отличным материалом для рентгеноструктурного анализа. Я отнес их Рэймонду Гослингу, у которого был наш единственный рентгеновский аппарат (собранный из списанных военными компонентов оборудования) и который использовал его для получения дифракционных снимков головок бараньих сперматозоидов.

Гослинг (1926–2015) в то время был аспирантом и работал под руководством Рэндалла. Он хранил нити ДНК во влажном состоянии (помня о работе Бернала с белками) и запечатывал их в капиллярные трубки, заполненные водородом, чтобы атомы углерода и азота из окружающего воздуха не влияли на картину рентгеновской дифракции. Хотя в 1950 г. Гослинг сумел получить дифракционные изображения ДНК, он был ограничен возможностями своего самодельного оборудования. Но в 1951 г. ситуация кардинально изменилась. Рэндалл не только получил новое оборудование, но и нанял еще одного сотрудника, Розалинд Франклин (1920–1958), чтобы решить проблему строения ДНК.

Франклин была экспертом в области рентгеновской кристаллографии и до этого работала в Париже, занимаясь исследованием структуры угля и получаемых из него соединений, однако никогда раньше не изучала биологические молекулы. Ее наняли на три года работать с белками и липидами, но, когда она пришла в Королевский колледж в январе 1951 г., Рэндалл уже решил предложить ей заняться анализом образцов ДНК Зигнера, причем Гослинг должен был стать ее ассистентом. Естественно, что Уилкинс был недоволен таким решением, и в ответ на его возражения Рэндалл разрешил ему заняться собственными исследованиями образцов ДНК, предоставленных Чаргаффом. В мае 1951 г. Уилкинс представил несколько снимков, сделанных совместно с Гослингом, на научной конференции в Неаполе, где они заинтересовали одного из молодых участников — американского биолога Джеймса Уотсона (род. 1928), который недавно защитил диссертацию и в тот год работал в Копенгагене, но вскоре должен был перебраться в Кембридж.

Франклин и Гослинг были слаженной командой. Гослинг умел получать кристаллическую ДНК — он был первым, кому это удалось, — а Франклин знала, как настроить новое оборудование, чтобы выжать из него максимум возможного. Они сделали первые снимки рентгеновской дифракции на кристаллах ДНК и обнаружили, что молекула существует в двух формах. При высокой влажности она выглядит как длинное тонкое волокно, но при высушивании она укорачивается и утолщается. Эти формы они назвали соответственно «B-форма» и «A-форма». Из-за наличия жидкости внутри клеток предполагалось, что В-форма больше походит на ДНК живых организмов.

Из-за соперничества между учеными Королевского колледжа Франклин по указанию Рэндалла занялась А-формой, а Уилкинс — B-формой. Дальнейший анализ показал, что обе формы, вероятно, имеют спиральную структуру, и в ноябре 1951 г. Франклин выступила в Королевском колледже с лекцией. В конспекте ее лекции содержалось следующее утверждение:

Результаты позволяют предположить спиральную структуру (которая должна быть очень плотно упакована), содержащую 2, 3 или 4 закрученных вокруг одной оси цепи нуклеиновых кислот на каждом витке спирали…

Уотсон присутствовал на этой лекции, а также обсуждал ДНК с Уилкинсом — на тот момент спиральная структура для В-формы ДНК была установлена надежнее, чем для А-формы. Но Уотсон всегда настаивал на том, что не помнит этого замечания Франклин. Еще один ученый из Королевского колледжа, Алекс Стоукс (1919–2003), воспользовавшись аналогией Флоренс Белл, предположил существование двойной спирали, в которой торчащие из сахарофосфатного остова основания были уложены друг на друга как «стопка монет» или как игральные карты при рифленой тасовке. Но оставалось еще много неясных деталей; для определения точного строения молекулы ДНК требовалось гораздо больше данных и проведение гораздо более глубокого анализа, что заняло весь 1952 г.

В начале 1953 г., когда стало очевидно, что обе формы ДНК имеют спиральную структуру, Франклин подготовила две научные статьи о том, что A-форма является двойной спиралью. Они были отправлены в журнал Acta Crystallographica, куда прибыли 6 марта. Это стало лебединой песней Франклин в Королевском колледже перед ее уходом в лондонский Биркбек-колледж. Она написала еще одну статью, датированную 17 марта 1953 г., в которой были представлены доказательства в пользу двуспирального строения B-формы ДНК. Но из-за событий в Кембридже эта статья не была опубликована в первоначальном виде, и о ней стало известно только после смерти Франклин. В это же самое время строение B-формы ДНК открыла другая команда ученых, которой Уилкинс, нарушив профессиональную этику, предоставил доступ к данным Франклин без ее ведома; в том числе он передал им один из ее (и Гослинга) лучших дифракционных снимков. Этот известный как «фото 51» снимок, на котором запечатлена рентгенограмма ДНК в самом высоком разрешении, доступном на тот момент, был сделан в мае 1952 г. На снимке четко просматривался крестообразный мотив, который мог отражать только спиральную структуру. Если можно сказать, что какое-то конкретное изображение открыло тайну строения ДНК, то это было фото 51.

Человеком, которому в январе 1953 г. показали эту фотографию и который поспешил с ней обратно в Кембридж, был Джеймс Уотсон. В своей книге «Двойная спираль» (The Double Helix) он писал:

Как только я увидел рентгенограмму, у меня открылся рот и бешено забилось сердце. Распределение рефлексов было неизмеримо проще, чем все, что получали раньше… бросавшийся в глаза черный крест мог быть лишь результатом спиральной структуры.

Такая реакция Уотсона объяснялась тем, что в Кембридже он вместе со своим коллегой Фрэнсисом Криком тоже работал над решением загадки строения ДНК. Крик (1916–2004) был физиком, который разочаровался в физике, приняв во время войны участие в создании ядерной бомбы, а потому в 1949 г., в возрасте 33 лет, занялся биологией и ушел писать диссертацию в отдел медицинских исследований Кавендишской лаборатории. Хотя он получил докторскую степень в 1953 г. за исследование белков и полипептидов, это произошло уже после того, как они с Уотсоном прославились благодаря внеурочной работе над строением ДНК.

Уотсон и Крик работали в одном помещении, так что Крик вскоре заразился энтузиазмом Уотсона и начал тайком от остальных исследовать ДНК вместе с ним. По сравнению с учеными из Королевского колледжа, оба они были дилетантами, которые мало знали об истории исследований ДНК, но их сильно впечатлил подход Полинга «от малого к большому». В перерывах между своими официальными исследованиями (Уотсон должен был работать с вирусом табачной мозаики) они пытались построить модель молекулы ДНК, но им мешало их собственное невежество. Прорыв произошел в июне 1952 г., после того как Крик обсудил эту проблему с биохимиком Джоном Гриффитом (1928–1972), племянником Фредерика Гриффита. Крику нравилась идея, что плоские основания с противоположных нитей ДНК могут укладываться друг на друга, как игральные карты при рифленой тасовке, и он спросил Гриффита, может ли тот определить, какие из оснований могут подходить одно к другому в такой стопке. Несколько дней спустя в очереди за чаем в столовой Кавендишской лаборатории Гриффит сказал Крику, что обдумал химические структуры оснований и считает, что аденин естественным образом соединяется с тимином, а гуанин — с цитозином. Крик мгновенно осознал, что это позволит происходить так называемой комплементарной репликации: если разделить нити, разорвав пары АТ и ГЦ, то все основания Ц одной нити соединятся со свободными основаниями Г, основания Т — с основаниями А, и т.д. Гриффит тоже догадался об этом, но благодаря своему знанию химии он понял кое-что еще, до чего Крик дошел не сразу. Обнаруженные Гриффитом свойства не способствовали тому, чтобы основания располагались стопкой одно над другим. Пары АТ и ГЦ могли соединяться друг с другом грань к грани при помощи комбинации водородных связей, причем каждая из этих пар имела одинаковую ширину, так что занимала бы один и тот же промежуток, соединяя две нити ДНК, как ступеньки винтовой лестницы.

Низкий уровень информированности Крика и Уотсона виден и по тому, что на тот момент они еще не слышали о «правилах Чаргаффа». Но в июле 1952 г. Чаргафф сам приехал в Кембридж, и Крик спросил у него, была ли хоть какая-то польза от анализа химического состава ДНК. Вот как об этом рассказывал сам Крик в своем интервью Роберту Олби в 1968 г.:

Чаргафф слегка настороженно сказал: «Ну разумеется, соотношение один к одному». Я спросил: «Что это?» Он ответил: «Но все это есть в публикациях!» Конечно же, я не читал этих работ, поэтому откуда мне было знать? Когда он мне все рассказал, я был потрясен. Поэтому я и сейчас это помню. Я вдруг подумал: «Господи, но раз есть комплементарные пары, то обязательно должно быть и соотношение один к одному». К тому времени я забыл все, что мне рассказывал Гриффит. Я не помнил, как назывались основания. Потом я пошел к Гриффиту, попросил его перечислить его парные основания и все записал. А потом я забыл, что сказал мне Чаргафф, и поэтому мне пришлось пойти и посмотреть его статьи. К моему изумлению, пары, которые назвал мне Гриффит, были теми же парами, о которых рассказывал Чаргафф.

Вооруженные этой информацией, фото 51 и другими данными из Королевского колледжа, в начале 1953 г. Крик и Уотсон разработали свою знаменитую модель ДНК, в которой все сходилось, если каждая молекула состояла из двух нитей, закрученных одна вокруг другой в виде двойной спирали, во внутреннем объеме которой основания располагались таким образом, чтобы основания одной нити соединялись с основаниями второй. Аденин всегда соединялся с тимином, а цитозин — с гуанином. Поскольку нити являлись зеркальными отражениями друг друга, если они разделялись, каждая достраивала новую двойную спираль путем добавления нужных оснований, чтобы создать нить-партнера.

Кроме всего прочего, такая структура ДНК несет информацию. Основания A, T, Г и Ц могут располагаться вдоль цепи в любом порядке, например AATЦAГTЦAГГЦATT… — как сообщение, написанное четырехбуквенным алфавитом. Даже двоичный компьютерный код, простой двухбуквенный алфавит, может нести любой объем информации (в том числе всю эту книгу), а четыре буквы тем более способны передать всю наследственную информацию при условии, что сообщения достаточно длинные. Крик и Уотсон завершили создание своей модели 7 марта 1953 г. и отправили статью в журнал Nature через день после того, как две статьи Франклин прибыли в редакцию Acta Crystallographica. Когда Уилкинс увидел препринт их статьи (к тому времени Франклин уже перешла в Биркбек-колледж), он предложил, чтобы его команда опубликовала короткую статью параллельно со статьей Крика и Уотсона «с демонстрацией спиральности в общих чертах», и вскользь заметил, что поскольку Франклин и Гослинг также собирались кое-что опубликовать, то должны быть «как минимум три короткие статьи в Nature».

Эти «три короткие статьи» были опубликованы в номере журнала от 25 апреля 1953 г. Первой шла статья Крика и Уотсона, в которой утверждалось, что их модель была разработана благодаря правилам Чаргаффа и что она была подтверждена данными рентгеноструктурного анализа, тогда как на самом деле модель была разработана благодаря рентгеноструктурным данным и подтверждена правилами Чаргаффа. Следующей шла статья Уилкинса, Стоукса и их коллеги Герберта Уилсона (1929–2008), в которой были суммированы сведения об исследованиях с применением рентгеновского излучения в качестве доказательства общей идеи о спиральной структуре ДНК. Последней шла статья Франклин и Гослинга с тем самым фото 51, которое сыграло ключевую роль в создании модели Уотсона — Крика. Никто, и точно не Франклин, не мог догадаться по содержанию этих статей, что фото 51 было так важно для Уотсона и Крика. Эта третья статья, по сути, являлась слегка измененной версией статьи, дописанной 17 марта, за день до того, как Уилкинс отправил в Кембридж предложение опубликовать «три короткие статьи». В статье приводились подробные сведения о строении двойной спирали, но без яркой идеи о принципе парной организации оснований.

В 1962 г. за эту работу Крик, Уотсон и Уилкинс получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Иногда утверждается, что Франклин стала очередной жертвой сексизма Нобелевского комитета; но в 1958 г. она умерла от рака, которым заболела, скорее всего, из-за работы с рентгеновским излучением. Она бы не смогла получить эту награду, даже если бы комитет премии захотел признать ее заслуги, потому что Нобелевская премия не вручается посмертно. Если кто-то и нуждается в нашем сочувствии, то это, безусловно, Гослинг, чья работа по кристаллизации ДНК и получению дифракционных снимков была очень важна. Нобелевские премии присуждались и за гораздо меньшие заслуги.

Но на открытии того, что ДНК является носителем генетического кода, рассказ о развитии нашего понимания эволюции не заканчивается. Биологам еще предстояло расшифровать этот код и выяснить, как генетическая информация передается от содержащихся в хромосомах молекул ДНК в прочие части клеток. Это привело — и приводит по сей день — к новым открытиям в области эволюции, в том числе довольно неожиданным. Оказалось, что, хотя Ламарк был, мягко говоря, не совсем прав, неправ он тоже был далеко не полностью.

Отправить