В понедельник поход в библиотеку показал: никто еще не пытался амплифицировать ДНК с помощью двух праймеров, и нет никаких очевидных причин, запрещающих это делать! Аналогичный результат дали беседы с коллегами. (Как это обычно бывает, много позднее дотошные люди откопали публикацию норвежского биохимика Хьелля Клеппе, работавшего у нобелевского лауреата Хара Гобинда Кораны, и их соавторов. Там были несколько фраз, очень похожих на описание принципа метода ПЦР, но они, по-видимому, так и не проверили эту идею экспериментально.)

Тем не менее докладом Муллиса никто не восхитился, на лабораторном семинаре в компании Cetus его едва слушали. К счастью, идеей заинтересовался один из двух лаборантов, Фред Фалуна, и с его помощью Кэри решил попытаться амплифицировать 400-нуклеотидный фрагмент ДНК человека – участок гена фактора роста нервов. (“Амплифицировать” как раз и значит “сделать множество копий этого участка”.) Муллис оптимистично предполагал, что этот ген может состоять из одного экзона и его удастся выцепить из цельной ДНК человека, без всякой возни с клонированием и колониями, с помощью реакции, которую он только что придумал.

Единственным человеком, кроме Фалуны, который разделял энтузиазм Кэри Муллиса летом 1983 г., был Рон Кук, основатель компании Biosearch – той самой, которая вывела на рынок первую коммерчески успешную машину для синтеза ДНК. Может, потому, что это было хорошо для его бизнеса, или потому, что он был рациональным химиком с неповрежденным мозгом, саркастически замечал Муллис в своей Нобелевской лекции. Именно Кук посоветовал ему, коль скоро никто в Cetus не принимает его идею всерьез, не делиться с нанимателями результатом, который не связан напрямую с его обязанностями, а самостоятельно довести ее до ума и самому запатентовать. Но Муллис сомневался, что это возможно, и ответил, что ему нравится Cetus и что компания его, конечно же, не обидит, если идея принесет прибыль.

В сентябре Кэри поставил первый опыт с геном фактора роста нервов: добавил в пробирку с человеческой ДНК праймеры и полимеразу и оставил ее на 12 часов. Но когда он провел электрофорез, никакой полосы, соответствующей фрагменту длиной 400 нуклеотидов, не появилось.

Пришлось признать, что реакция не будет совсем уж простой. Дело в том, что двунитевая ДНК распадается на две свободные нити при определенной температуре (94–95° С), а комплементарные нити слипаются, подобно половинкам застежки-молнии, при низкой (желательно не выше 68° С). Для описания этих процессов молекулярные биологи заимствовали термины из металлургии, двунитевая ДНК у них “плавится”, коротенькие праймеры “отжигаются” на свободную нить.

Конечно, живая клетка не должна нагреваться и остывать каждый раз, как захочет копировать свою ДНК, – в клетке расплетание и заплетание двойной спирали обеспечивают специальные белки. Но в пробирке проще действовать чистой физикой, чем добавлять все эти белки.

Соответственно, цикл усложняется: нагреть раствор с образцом ДНК – добавить праймеры – охладить пробирку – добавить ДНК-полимеразу – провести реакцию – нагреть пробирку – охладить пробирку и добавить новую полимеразу, потому что старая сварилась при нагреве и потеряла активность – провести реакцию… Чуть больше возни, но ради великой цели можно и повозиться.

В этот момент отношения Кэри и Дженнифер окончательно испортились, и научные успехи его мало радовали. Первый удачный эксперимент состоялся лишь 16 декабря 1983 г. На этот раз Муллис поставил себе более скромную задачу: амплифицировать определенный участок плазмиды pBR322, привычного инструмента молекулярщиков. И все получилось.

В 1985 г., отшлифовав метод, Муллис отправил статью о нем в Nature. Этой статье не так повезло, как той его дебютной, про обратное течение времени, – она не была опубликована. Рецензенты нашли ее чисто технической и неоригинальной. Публикация в Science состоялась, хотя и не с первого захода. Было даже так: в 1985 г. вышла статья сотрудников Cetus, с Муллисом в середине списка соавторов, о применении ПЦР для исследования гена бета-глобина на предмет поиска мутаций, приводящих к серповидноклеточной анемии. Статья собственно про ПЦР – про ПЦР как метод амплификации ДНК – увидела свет в 1988 г.

К тому времени полимеразная реакция уже вышла в публичное пространство – после того, как у Муллиса появилась возможность представить ПЦР на майском симпозиуме 1986 г. в знаменитой лаборатории Колд-Спринг-Харбор. Реакция научного сообщества была быстрой и впечатляющей. Cetus начала получать множество запросов о PCR, это заставило руководство внимательнее присмотреться к выдумкам Муллиса и изучить возможности дальнейшего развития технологии. Компания позволила автору посвятить все время совершенствованию ПЦР и, когда он добился успеха, наградила его беспрецедентно большим бонусом в $10 000. Позднее Cetus продала патент на ПЦР за $330 млн компании Hoffmann-La Roche. Говорили ему умные люди… Правда, сама Cetus примерно в то же время прекратила существование, в июле 1991 г. было объявлено о ее слиянии с биотехнологической компанией Chiron. Юридическая часть истории на этом не заканчивается, там еще много интересного. Права на метод в итоге принадлежат Hoffmann-La Roche и ее “дочке” Roche Molecular Systems, у них более тысячи патентов и заявок, так или иначе связанных с ПЦР.

Научное сообщество воздало должное Кэри Муллису. В 1989 г. Science объявил полимеразу “молекулой года”. В 1993 г. Муллису за изобретение ПЦР была присуждена Нобелевская премия. Десять лет с той ночи на трассе, пять лет с публикации – можно сказать, высшее признание пришло практически мгновенно! Лекцию новоиспеченный нобелиат прочел ироничную, местами провокационную, как и следовало ожидать, и всячески подчеркивал, что успех ПЦР в то время очень мало вознаградил его за потерю Дженнифер, “этой прекрасной, сумасшедшей женщины-химика”.

Компанию Cetus Муллис покинул еще в 1986 г., недовольный обращением с ним и с другими сотрудниками в группе ПЦР, – с выходным пособием в размере зарплаты за пять месяцев. Занимался он с тех пор многим, но, как правило, “избегал занудства”, используя выражение Джима Уотсона. И это мягко сказано.

Муллиса вспоминают все журналисты, которым надо рассказать о том, какими странными бывают нобелевские лауреаты. Он публично заявлял, например, что причина СПИДа – вовсе не вирус иммунодефицита человека, по крайней мере не только вирус. Он отрицал изменение климата на Земле; обозвал социологию “бесполезной наукой” за то, что она не желает считаться с астрологическими прогнозами. Муллис не скрывает, что в молодости принимал ЛСД, подчеркивает, что это было обычной практикой в то время и что этот опыт дал ему “больше, чем любые курсы”. Впрочем, как он особо отмечает, он не был под веществами, когда в 1985 г. повстречал в лесу зеленого светящегося енота – посланца инопланетян. Говорит он и более возмутительные вещи – например, о том, как вредны для науки приверженность догмам, грантовая система и попытки коммерциализации.

Его автобиография называется “Танцуя нагишом на поле разума” (Dancing Naked in the Mind Field). Не удержусь от короткой цитаты: “Нам повезло, что в нашем детстве русские были врагами. Мы тренировались прятаться под партами на тот случай, если бы они осмелились сбросить ядерную бомбу на Колумбию, Южная Каролина, во время уроков. В 1957 году русские запустили космическую гонку, отправив Спутник I на орбиту вокруг Земли. Он был всего двадцати трех дюймов в диаметре, но это революционизировало американскую образовательную систему. Правительство влило миллионы долларов в научное образование. Это было удачное время, чтобы быть молодым и влюбленным в науку”. Рассуждение вполне в духе Кэри Муллиса. Наверное, так говорить нехорошо – “повезло, что были врагами”. Надо бы придумать другие способы, побуждающие правительство вливать миллионы в научное образование.

После ухода из Cetus Муллис два года проработал директором по молекулярной биологии компании Xytronyx. Выступал консультантом по научным вопросам, в том числе и на судебных процессах. В 1992 г. основал бизнес по продаже украшений, содержащих амплифицированную ДНК покойных знаменитостей – Элвиса Пресли, Мэрилин Монро. С 2003 г. по настоящее время он руководит созданной им компанией Altermune LLC. Компания планирует реализовать оригинальную идею: вызывать у организма иммунный ответ против определенного вещества (которое вызывает иммунный ответ всегда) и с помощью особых молекул-адапторов перенаправлять этот ответ на патоген, который надо уничтожить,. Удачи ему – а мы продолжим об амплификации ДНК.

Итак, какие возможности принесла в молекулярную биологию полимеразная реакция с двумя праймерами?