Салат из ДНК и саузерн-блоттинг
К тому времени любимым инструментом молекулярных биологов стали ферменты рестриктазы. Эти ферменты открыл Хэмилтон Смит (Нобелевская премия 1978 г.). Замечательны они тем, что отыскивают в ДНК определенные “слова” (например, GGGCCC или CGTACG) и разрезают обе нити именно в этих местах. Такие участки называются сайтами рестрикции. Рестриктазы применяются для нарезания сверхдлинных молекул на удобные фрагменты, не слишком большие и не слишком маленькие, которые потом сортируют по длине с помощью электрофореза в геле.
Но, если нарезать рестриктазами всю ДНК, выделенную из некоего образца (тотальную ДНК), получится порядочная каша – слишком много фрагментов, чтобы в них можно было разобраться. И тут опять помогает бесценное свойство молекул ДНК – комплементарность. Если у нас есть кусочек ДНК, комплементарный искомому гену (допустим, мы уже изучили другой ген, похожий, и взяли его фрагмент; дальше будет именно такой пример), то мы можем как-то пометить этот кусочек, хотя бы теми же радиоактивными изотопами. Он будет играть роль зонда – свяжется со своим комплементарным участком в ДНК, разогнанной на электрофорезе, и это решит проблему. Будет видна в простом случае (если этот участок встречается в ДНК один раз) одна полоска, а если несколько – то все же несколько, а не неизвестно сколько. Общая картина определяется взаимным расположением искомых участков и сайтов рестрикции. Этот метод получил название саузерн-блоттинга (“саузерн” – в честь изобретателя, британского молекулярного биолога сэра Эдвина Саузерна, а blot по-английски “пятно”).
ДНК-блот, или саузерн-блот, или саузерн-блоттинг, – метод выявления определенной нуклеотидной последовательности ДНК в образце. ДНК обрабатывают рестриктазами, получившиеся фрагменты разгоняют на электрофорезе. Затем накладывают на гель листок нитроцеллюлозной или нейлоновой мембраны и плотно прижимают. ДНК при этом отпечатывается на мембране и довольно прочно связывается с ней (мембрана заряжена положительно, а ДНК, как мы помним, отрицательно). Для окончательного закрепления мембрану сушат в вакууме, нагревают или освещают УФ-излучением. Потом ее опускают в раствор, содержащий зонд – однонитевую молекулу ДНК, комплементарную участку той последовательности, которая нас интересует. Зонд гибридизуется (связывается) с ДНК образца; двухцепочечные участки к тому моменту расплетаются – денатурируют, так что с этим проблем не возникает. Молекула-зонд каким-то образом помечена (содержит радиоактивный изотоп или к ней прицеплена молекула красителя), и в результате на мембране-блоте появится радиоактивная или окрашенная полоска – она соответствует фрагменту ДНК, который содержит участок, комплементарный зонду. Радиоактивную полоску мы можем увидеть таким же способом, как и полоски на геле после секвенирования, – приложив мембрану к рентгеновской пленке на некоторое время и затем проявив ее. Таким способом, например, можно прикинуть, сколько раз эта последовательность встречается в геноме. А можно вырезать соответствующую метке полоску из геля, выделить из нее ДНК (после блоттинга ее там осталось еще много, не вся ДНК связалась с мембраной) и исследовать дальше именно нужный фрагмент.
“Southern” в переводе с английского – “южный”, и вполне естественно, что основанный на аналогичном принципе метод определения мРНК в образце получил название “нозерн-блоттинг”, а метод определения специфических белков – “вестерн-блоттинг”, то есть северный и западный соответственно. Сам Эдвин Саузерн, по свидетельству того же Алека Джеффриса, никогда не называл свой метод отпечатков “саузерн-блоттингом”, а скромно говорил “перенос ДНК”.
В 1977 г. (статья Сенгера о секвенировании методом терминаторов только что опубликована) Джеффрис вернулся в Великобританию, в Лестерский университет, чтобы “поженить новые технологии, которыми пользовалась молекулярная биология, с генетикой человека”. По его словам, идея использовать эти технологии для поиска наследуемых индивидуальных вариаций в геноме появилась уже тогда. Через семь лет, в 1984 г., Алек Джеффрис открыл “метод отпечатков пальцев ДНК”, который часто называют более коротко, калькой с английского, “ДНК-фингерпринтинг” или “ДНК-фингерпринт”.
Очевидно, что в геномах у разных людей должны быть различия, но как найти эти крошечные индивидуальные различия среди миллиардов букв? Оказалось, для этого необязательно секвенировать весь геном. Можно использовать саузерн-блоттинг.
Алек Джеффрис одним из первых описал феномен полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism, RFLP). Два образца ДНК – допустим, взятые у двух разных людей – обрабатывают одной и той же рестриктазой, потом гибридизуют отпечатки на мембране с одним и тем же зондом и получают неодинаковые картинки, длины меченых фрагментов не совпадают. Почему так происходит?
Оказалось, у некоторых людей может отсутствовать тот или иной сайт рестрикции по причине замены одного нуклеотида, например GGGCCC у них превращается в GGТCCC. Рестриктаза теперь его не узнаёт – она сурова, как поисковик программы Word, и, в отличие от Google, не делает поправок на опечатки. Если обработать рестриктазой ДНК человека с такой мутацией, то вместо двух коротких фрагментов, как у большинства людей, у него получится один длинный. И та же картина может наблюдаться у потомков этого человека.
