Главными святынями Донской обители являются мощи святителя Патриарха Тихона и Донская икона Божьей Матери.

Иконографичесская композиция Донской иконы — Богородица Умиление. Отличительная особенность — обнаженные до колен ножки Богомладенца. Золото фона и полей практически полностью утрачено. Отсутствуют и надписи и перекрестие нимба Младенца.

Мафорий Богородицы украшен золотым орнаментом, в который вплетены буквы (распространенная практика в византийском и древнерусском искусстве).

Также в Донском монастыре весьма почитаются иконы Богородицы Федоровская и «Знамение» и образ преподобного Серафима с частицей его мощей.