Как мы увидели, не существует «идеального» биомаркера старения. В связи с удешевлением современных высокопроизводительных методов изучения биологических молекул многообещающим подходом может стать полный анализ и сопоставление профилей ДНК, РНК, белков и метаболитов людей разных возрастов с разным спектром хронических заболеваний.

Наука, изучающая структуру и функции совокупности всех наших генов, – геномика, белков, – протеомика, метаболитов, – метаболомика. Опираясь на сходство окончаний в этих терминах, биомаркеры, разрабатываемые в рамках этих наук, называют омиксными. Старение – слишком сложный процесс, чтобы полагаться на изменение одного-двух показателей. Поэтому, опираясь на современные технические возможности, исследователи стали анализировать «омики», то есть все совокупности генов, транскриптов, метаболитов и белков (табл. 2).

¹ Присоединение метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК.

² Класс ядерных белков, выполняющих две основные функции: они участвуют в упаковке нитей ДНК в ядре и в эпигенетической регуляции таких ядерных процессов, как транскрипция, репликация и репарация.

³  Белки, структура которых в основном совпадает со структурой гистона, но свойства несколько изменены из-за различий в аминокислотной последовательности.

⁴ Закономерная регулярность, образец, рисунок.

⁵ Малые молекулы РНК, не кодирующие белок, принимающие участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции активности генов путем РНК-интерференции.

¹ Матричная РНК, содержащая информацию о первичной структуре (аминокислотной последовательности) белков.

Наиболее развит и доступен каждому уже сейчас геномный подход. Строго говоря, исследования генома не дают нам биомаркеров старения. В геноме лишь кроется ключ к наследственным задаткам, которые достались нам от родителей и свидетельствуют, например, о потенциальном риске синдромов ускоренного старения (наследственных болезнях, при которых в 30 лет люди становятся глубокими старцами) или предрасположенности к тому или иному возрастзависимому заболеванию (раку, сахарному диабету 2-го типа, нейродегенерации). Учет таких рисков и коррекция в соответствии с ними образа жизни и частоты профилактических обследований – залог здорового долголетия. В ряде случаев, когда речь идет о накопленных с возрастом соматических мутациях, анализ генома какой-либо ткани (например, клеток крови или кожи) может помочь спрогнозировать риск развития патологии, например опухоли, или оценить общий темп старения.

В основе определения генетической предрасположенности лежит несколько видов анализа.

Во-первых, это исследование снипов – вариаций последовательности ДНК, когда один из нуклеотидов в геноме одного индивидуума отличается от другого. Анализ предрасположенности по снипам стал возможен благодаря масштабным исследованиям ассоциации между заболеваемостью и последовательностью генома у большого количества людей по всему миру.

Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) привели к обнаружению многих снипов, тесно связанных с хроническими заболеваниями, являющимися основными причинами смерти человека (ишемическая болезнь сердца, рак, сахарный диабет 2-го типа) (рис. 14). В настоящее время одновременный анализ сотен тысяч снипов позволяет оценивать риск развития около трех сотен хронических (разные формы рака, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания, сахарный диабет 2-го типа) и наследственных (включая синдромы ускоренного старения Вернера и Хатчинсона – Гилфорда) заболеваний.

Рис. 14. Результаты 1675 GWAS исследований позволили выявить 5303 снипов социально значимых заболеваний (по Hnisz et al., Cell 2013).

Все хронические заболевания являются многофакторными, потому что помимо генетической основы в их развитии важную роль играет образ жизни. Людям, у которых высокий генетический риск данных заболеваний, крайне важно следить за своим питанием и физической активностью, потому что своевременное вмешательство в образ жизни способно не дать риску реализоваться.

Генотипирование помогает выявить генетическую предрасположенность к тем или иным заболеваниям для того, чтобы заранее заняться его профилактикой. Часто бывает достаточно изменить образ жизни, чтобы не провоцировать заболевание. Риск, даже если он высокий, – это не будущий диагноз, и это важно понимать.

Для правильного понимания выявленных рисков необходимо построить генеалогическое древо с врачом-генетиком, изучить имеющиеся медицинские документы (анализы, выписки из медицинской карты и др.). Только в совокупности с данными об образе жизни, генеалогии и медицинской истории можно прогнозировать повышение или снижение тех или иных рисков.

Кроме того, по данным генетического теста выявляется индивидуальная реакция на десятки лекарственных препаратов, наследуемость личных качеств, особенности переносимости тех или иных продуктов питания (алкоголя, лактозы, глютена и т.д.).

Во-вторых, в основе анализа генетической предрасположенности лежит изучение вариации количества копий (CNVs) – изменение количества копий (удвоение или выпадение) одного или нескольких участков ДНК. Самым ярким представителем заболеваний этого класса является болезнь Хантингтона. Многократное умножение повтора нуклеотидов ЦАГ в гене IT-15 приводит к образованию токсичного белка хантингтина, вызывающего гибель нервных клеток и тяжелое расстройство нервной деятельности. Избыток или недостаток определенных участков ДНК на хромосомах, как теперь ясно, играет роль в возникновении различных типов опухолей, возрастной макулярной дегенерации, болезни Альцгеймера.

Генотипирование сегодня получает все более широкое распространение. Теперь даже необязательно обращаться к врачам, чтобы пройти генетическое тестирование. Достаточно заказать комплект для сбора слюны, из которой потом в лаборатории выделят ДНК и проведут анализ. Самый распространенный в России тест подобного рода – это генетический тест «Атлас». Набор для сбора слюны – это пробирка, в которую необходимо собрать один миллилитр собственной слюны. Затем пробирку надо закрыть. При этом высвобождается консервант, находящийся в ее крышке, который и сохранит ДНК в целости, пока пробирка не поступит в лабораторию. Через три недели (именно столько времени занимает процесс выделения ДНК и ее анализа) человек получает информацию обо всех основных генетических рисках на личную интернет-страницу, защищенную паролем. Очень важно отметить, что одновременно он получает рекомендации по профилактике этих рисков, составленные врачом-генетиком. Соблюдение подобных рекомендаций позволяет отсрочить или даже избежать развития возрастзависимых заболеваний. Для того чтобы быть в курсе, не появились ли начальные признаки заболевания, человеку необходимо будет внимательно отнестись к выявленным рискам, обследоваться и наблюдаться у врача, к специальности которого относится выявленная предрасположенность, с периодичностью не реже чем раз в год.

Раньше прием у врача, который бы разбирался в результатах генетического тестирования, можно было пройти только в Европе или США. Но сегодня благодаря появлению персонализированной медицины в России это можно сделать, не уезжая за границу. Самым известным медицинским центром, в котором врачи обладают знаниями по работе с генетическим тестом, является медицинский центр «Атлас». Каждый врач перед выходом на работу проводит определенное время на семинарах, посвященных технологии исследования и процессу расчета риска. Врач учится правильно интерпретировать данные генетического теста, чтобы уметь работать не только с уже развившимся заболеванием, но и с риском его возникновения.

В качестве примера использования генетического теста для выявления вероятности долголетия можно вспомнить о гене APOE, определенные варианты которого никогда не встречаются у долгожителей. Это значит, что такие варианты предрасполагают к развитию возрастзависимых заболеваний. Вариант гена APOE, который называется e4, связан с более высоким риском развития атеросклероза и болезни Альцгеймера. Но даже наличие этого варианта не приговор, так как на его проявление можно влиять изменением образа жизни – начиная со всем известных рекомендаций по здоровому питанию и физической активности, уменьшению употребления алкоголя и отказу от курения и заканчивая рекомендациями по употреблению продуктов питания, богатых омега-3.

Активность генов при старении сопровождается усилением хаотичности, «информационного шума». Те гены и даже бессмысленные повторяющиеся последовательности генома, которые в норме должны «молчать», активизируются, что сбивает тонкую настройку клеточного метаболизма. По-видимому, это связано со снижением точности регуляции активности генов. Такого рода изменения активности многих генов могут лежать в основе большинства возрастных заболеваний.

В проекте EuroBATs обследовали около 900 женщин-близнецов разного возраста из Великобритании. У них брали образцы жировой ткани, кожи, лимфобластоидные клетки и цельную кровь. По данным доктора А. Винуэлы, наиболее статистически значимые изменения с возрастом отмечались в коже: 3,3 % всех генов (их у нас порядка 20000) меняло свою активность. Например, изменялся уровень мРНК генов, которые регулируют окислительно-восстановительный баланс, синтез РНК, функционирование митохондрий, метаболизм жирных кислот и холестерина. Это обнадеживающий результат, так как кожа отражает глубинные возрастные процессы, при этом являясь одним из наиболее доступных для лабораторного анализа органов. К тому же она – удобная мишень для антивозрастных терапий, эффективность которых возможно будет оценивать по вновь выявленным маркерам старения клеток кожи.

Жоао-Педро де Магалхаес из Ливерпульского университета сопоставил большие массивы данных, относящихся к различным тканям человека (головному мозгу, почкам и скелетным мышцам) и обнаружил закономерные изменения в активности десятков генов. Во всех тканях перечисленных органов с возрастом происходит активация генов, связанных с подавлением процессов клеточного роста и упаковкой белков, генов факторов воспаления, ответа на оксидативный стресс и воздействие тяжелых металлов. Кроме того, в головном мозге активируются гены клеточной гибели. Напротив, в изученных тканях подавлены гены, связанные с выработкой АТФ в митохондриях.

Ученые из медицинской школы университета Эксетера использовали транскриптомный подход, чтобы подобрать воспроизводимый набор генов, меняющих свою активность в разных тканях (мышцы, кожа, ткань головного мозга) при старении практически здоровых людей в возрасте старше 65 лет. При этом анализ активности этих генов можно проводить, ограничиваясь лишь забором крови пациента. Таких генов, составляющих универсальный профиль старения, оказалось всего 150.

Помимо изменения активности генов, кодирующих белок, с возрастом меняется уровень экспрессии определенных регуляторных микроРНК. Такие РНК не кодируют белки, а выполняют функцию регуляторов, как правило, выключая биосинтез некоторых белков, подавляя активность их генов. Как показали онкологические исследования, профили микроРНК обладают даже большей предсказательной силой, чем профили матричной РНК. Под профилем понимается определенный набор изменений в спектре молекул мРНК в данной клетке или ткани.

Изменение активности генов связано с эпигенетическими изменениями на разных уровнях – ДНК, РНК, белок (табл. 3), приводящими к выключению одних и включению других генов. Большинство этих изменений связано с попыткой ответа клеток и организма на накопление ошибок, в том числе ведущих к старению (выходу из репродуктивного цикла) или гибели клетки. Эти реакции возникли в эволюции для того, чтобы предотвратить опухолевое перерождение поврежденной клетки. Однако чрезмерный ответ на стресс (клеточное старение и гибель клеток) даже более опасен с точки зрения старения всего организма, чем вызвавшие его повреждения.

Один из ключевых механизмов выключения гена – метилирование его ДНК. Исследователи из группы В. Вагнера показали, что характер метилирования последовательности ДНК всего трех генов в клетках крови человека позволяет довольно точно (± 5 лет) судить о биологическом возрасте, а также предсказать ускоренное старение. За последние два года было выполнено несколько десятков исследований, в которых по уровню метилирования ДНК определенных генов удалось оценить скорость старения той или иной ткани или организма в целом.

Регуляция связанных с ДНК белков – гистонов претерпевает возрастзависимые изменения, которые сказываются на уровне активности многих генов, что является важным механизмом старения. Например, систематическое кислородное голодание тканей и хроническое воспаление через различные механизмы приводят к активации фермента, снимающего метильную метку с гистоновых белков. Изменение уровня метилирования гистонов связано с активацией гена циклинзависимой киназы p16, останавливающей репродукцию клетки. Экспрессия p16 является характерным биомаркером клеточного старения. Кроме того, деметилирование определенных гистонов приводит к образованию обширных участков выключенного, неактивного генома. Благодаря плотности упаковки ДНК такие участки можно прокрасить и наблюдать в люминесцентный микроскоп. Они дают нам еще один биомаркер старения клетки. Напротив, с репликативным возрастом клетки происходит утрата гетерохроматина по периферии ядра, который играл важную роль в пространственной упаковке хромосом в ядре и в прикреплении хромосом к ядерной оболочке. Повреждение ДНК клетки, нередко сопровождающее старение, вызывает фосфорилирование одного из гистоновых белков (H2AX), который запускает каскад процессов, заканчивающихся наработкой в клетке еще одного ингибитора циклинзависимых киназ – р21 и остановкой цикла деления клетки.

Гены кодируют белки-ферменты, исполняющие роль посредников и катализаторов различных метаболических процессов в организме, таких как клеточное дыхание, биосинтез других белков, липидов, углеводов, малых органических молекул.

Метаболомика, согласно Д. Промыслову, имеет ряд преимуществ над другими «омиками». Метаболом весьма чувствителен и предсказуем по отношению к физиологическому состоянию организма. Старение и вмешательства, которые влияют на старение (например, диета), заметно изменяют структуру метаболомной сети. Метаболомный подход является весьма удобным для клинического применения.

Магнитный резонанс (МР) стал главным рабочим инструментом при изучении метаболитов в плазме и сыворотке крови, в образцах мочи. МР-профиль отображает набор резонансов, вызываемых большинством молекул с низкой молекулярной массой, таких как кетоновые тела, органические кислоты, короткоцепочечные жирные кислоты, аминокислоты, фенолы, индолы, ксенобиотики, осмолиты, желчные кислоты. Еще более мощным высокопроизводительным методом метаболомики является Orbitrap масс-спектрометрия.

В плазме крови человека постоянно циркулирует несколько сотен метаболитов. Поскольку кровь омывает все органы, ее состояние может быть интегральным показателем здоровья и скорости старения тела. Как показали результаты исследования Т. Ванг, одновременное повышение в плазме крови уровня метаболитов изоцитрата и таурохолата и некоторых других может свидетельствовать о более низких шансах дожить до 80 лет (табл. 4). Избыток циркулирующего изоцитрата к тому же свидетельствует об увеличении риска сердечно-сосудистых заболеваний. При старении в крови существенно повышается соотношение меди и цинка. Возрастают гомоцистеин и мочевая кислота, которые являются воспалительными маркерами, связанными с сердечно-сосудистыми заболеваниями и гипертонией.

Совокупность жиров (называемая липидόм) давно привлекает внимание в связи с возрастом и долголетием. Относительно давно установлено, что при старении в некоторых случаях в крови увеличивается концентрация общего холестерина и свободных жирных кислот.

Протеомика циркулирующих в крови белков также представляет большой интерес. Среди белков плазмы крови много потенциальных биомаркеров скорости старения (табл. 5).

Липиды транспортируются в крови в комплексе с особыми белками-переносчиками. С точки зрения долголетия важно преобладание липопротеинов высокой плотности над липопротеинами низкой плотности и отсутствие избытков еще одного липида – холестерина. Повреждение глюкозой (гликирование) белка ApoB100 в составе липопротеинов низкой плотности ведет к потере его способности взаимодействовать с тканевыми рецепторами, обеспечивающими доставку жиров в клетки тела. Поврежденный ApoB100 начинает восприниматься организмом как чужеродный, вызывающий иммунный ответ. Липопротеины низкой плотности из-за меньших размеров легче проникают в стенку сосуда, где благодаря измененному ApoB100 атакуются иммунными клетками (макрофагами) и фагоцитируются (поглощаются и разрушаются ими). Макрофаги, скопившие много холестерина, превращаются в пенистые клетки, которые погибают, в результате чего кристаллы холестерина откладываются внутри стенки сосудов. Просвет сосуда сужается, он становится более хрупким, и кровоснабжение органов и тканей ухудшается.

Неферментативное гликозилирование (гликирование) является распространенным механизмом повреждения белков в живом организме. Оно происходит в результате химической реакции (реакции Майяра) между глюкозой и аминогруппами в составе белков. Те же самые процессы, только в ускоренном темпе, происходят при образовании золотистой корочки при поджаривании мяса. Очень медленно стенки наших сосудов «поджариваются», разнося по тканям теплую кровь, насыщенную глюкозой и другими сахарами. В процессе старения происходит заметное накопление долгоживущих белков, подвергшихся гликированию, таких как коллагены, эластин (в стенке сосудов) и хрящевые белки (в суставах). Гликированные белки склонны к перекрестным сшивкам с образованием так называемых конечных продуктов гликирования (КПГ). Перекрестные сшивки между белками стенки сосуда снижают его эластичность и изменяют проницаемость сосуда для метаболитов. КПГ к тому же взаимодействуют с особыми рецепторами на поверхности клеток, вызывая воспалительные реакции. КПГ участвуют в возникновении многочисленных возрастных заболеваний, например, нейродегенеративных, сердечно-сосудистых и почечных. Конечные продукты гликирования можно измерить в плазме крови или даже на поверхности кожи с помощью флуоресцентной спектроскопии. Кроме того, применяют иммунологический анализ на карбоксиметиллизин, пентозидин, аргпиримидин, имидазолон. Уровень гликирования белков может быть оценен по количеству гликированного гемоглобина (HbA1c). Существенное превышение нормы по данному показателю может быть следствием развития сахарного диабета. Настольный прибор AGE Reader измеряет накопление в ткани КПГ с помощью флуоресцентных методов – измерения аутофлуоресценции кожи в определенном диапазоне длин волн.

N-гликозилирование – это присоединение молекулы разветвленной цепочки сахаров (гликана) к белку с помощью специализированных ферментов. В результате образуется гликопротеин – молекула, состоящая из углевода и белка. Эта модификация позволяет белкам содействовать работе иммунной системы, участвовать в распознавании «свой – чужой». Гликаны часто производятся иммунной системой в ответ на заболевание. Не нужно путать N-гликозилирование с уже известным нам гликированием – спонтанным взаимодействием сахара и какого-либо белка, в результате которого белок повреждается и его функция теряется. При старении меняется спектр сахарных цепочек, присоединенных к белкам при N-гликозилировании. Это изменение является одной из причин хронических воспалительных процессов. Г. Лаук и коллеги показали, что уровень гликозилированных антител IgG в крови коррелирует с возрастом человека даже в большей степени, чем укорочение теломер, и может эффективно применяться для расчета биологического возраста человека.

Профессор университета Болоньи К. Франчески на основании данных европейского исследования биомаркеров старения MARK-AGE (2008–2013 гг.) разработал тест на биологический возраст GlycoAgeTest, учитывающий логарифм соотношения количеств определенных гликанов – NGA2F, уровень которых с возрастом увеличивается, и NA2F, которых с возрастом становится все меньше. Чем больше значение критерия GlycoAgeTest, тем старше человек с биологической точки зрения.

Еще один гликопротеин, количество которого зависит от возраста, – аполипопротеин J (кластерин). Пространственная укладка полипептидной цепочки любого белка играет определяющую роль в выполнении им своей функции. Кластерин помогает другим белкам сохранить правильную укладку, стабилизирует ее. Поскольку в процессе старения скапливаются денатурированные белки, нарастает и количество кластерина. Таким образом, он оказался ценным биомаркером старения. Его уровень повышен у пациентов с сахарным диабетом типа 2, ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда. Его уровень можно измерять в сыворотке крови.

Давно известно, что при старении постмитотических тканей, таких как скелетная мускулатура, сердечная мышца, головной мозг, в больших количествах накапливаются агрегаты окисленных белков. Окисление белковой молекулы приводит к утрате поверхностного заряда и растворимости белка в воде. Нерастворимые белки начинают образовывать фибриллы и бляшки, так называемый амилоид. Наиболее известными формами старческого амилоидоза является болезнь Альцгеймера, а также амилоидоз сердца и почек. Увеличение доли окисленных белков при старении связано с накоплением дефектных митохондрий, в избытке выделяющих свободные радикалы, с подавлением процессов репарации и деградации поврежденных белков. Поэтому показателями скорости старения являются как снижение активности механизмов деградации – аутофагии (внутриклеточного переваривания поврежденных структур) и протеасомы (расщепления ненужных белков до аминокислот), так и репарации окисленных белков через систему метионин сульфоксидредуктазы. Данные изменения в качестве биомаркеров старения удобно наблюдать в мононуклеарных клетках периферической крови.

Как показали исследования Шиффера и коллег, короткие белки (пептиды) в моче, например, фрагменты коллагена-1 типа I и III, служат отличными маркерами как старения, так и хронической болезни почек и ишемической болезни сердца.