Новые открытия, связанные с гиппокампом (клетки места, NMDA-рецепторы и долговременная потенциация), открывали перед нейробиологами увлекательные перспективы. Но оставалось непонятным, как карта пространства и долговременная потенциация связаны друг с другом и с работой эксплицитной памяти. Начать с того, что, хотя долговременная потенциация в гиппокампе и оказалась интереснейшим и широко распространенным явлением, это был во многом искусственный способ вызывать изменения синаптической силы. Даже Лемо и Блисс в связи с этой искусственностью задавались вопросом, «пользуются или нет интактные животные в своей естественной среде тем свойством, которое было выявлено с помощью повторяющихся синхронных импульсов». Более того, казалось маловероятным, что серии импульсов того же характера возникают и в ходе обучения. Многие ученые сомневались, что изменения синаптической силы, происходящие при долговременной потенциации, играют какую-либо роль в пространственной памяти или в формировании и поддержании карты пространства.

Я начал понимать, что идеальным способом изучения этих связей было бы использование генетических методов, подобных тем, которые применял Сеймур Бензер в исследованиях обучения у дрозофил. В восьмидесятые годы биологам удалось объединить методы селекции с методом рекомбинантной ДНК для получения генетически модифицированных мышей. Эта технология позволяла манипулировать генами, лежащими в основе долговременной потенциации, в поисках ответа на некоторые актуальные вопросы, которые меня интересовали. Состоит ли долговременная потенциация из разных фаз подобно долговременному усилению синаптических связей у аплизии? Если да, то соответствуют ли эти фазы формированию кратковременной и долговременной пространственной памяти? Если между ними есть соответствие, мы могли бы вмешаться в одну из фаз долговременной потенциации и определить, что происходит с картой пространства в гиппокампе в процессе обучения и запоминания новой окружающей среды.

Я был счастлив вернуться к работе с гиппокампом — вновь обретенным предметом давней страсти. Я следил за успехами исследований в этой области, поэтому не почувствовал, что прошло уже тридцать лет. С Пером Андерсоном, как и с Роджером Николлом, меня связывали дружеские отношения. Но главным побудительным мотивом были воспоминания о совместных экспериментах с Олденом Спенсером, поставленных, когда мы работали в Институтах здоровья. Я снова испытал восторг работы на пороге новых открытий, но на этот раз я был вооружен молекулярно-генетическими методами, об избирательности и других возможностях которых мы с Олденом не могли и мечтать.

Эти достижения молекулярной генетики стали возможными благодаря успехам селекции мышей. Эксперименты поставленные в конце XX века, показали, что разные линии лабораторных мышей отличаются не только геномами, но и поведением. У одних обнаружились исключительные способности к выполнению различных заданий, в то время как другие проявляли в тех же экспериментах исключительную бестолковость. Эти результаты показывали, что гены играют в обучении заметную роль. Мыши разных линий отличаются друг от друга также по степени пугливости, общительности и развития материнских способностей. С помощью близкородственного скрещивания и выведения линий с повышенной или пониженной пугливостью исследователям генетики поведения удалось преодолеть случайный характер естественного отбора. Так селекция стала первым шагом на пути выявления генов, ответственных за определенные формы поведения. Теперь метод рекомбинантной ДНК давал возможность не только выявлять задействованные гены, но и исследовать их роль в изменении синапсов, лежащем в основе определенных форм поведения, эмоциональных состояний или способностей к обучению.

До 1980 года молекулярная генетика мышей полагалась на классические методы так называемой прямой генетики, которыми, в частности, пользовался Бензер в экспериментах с дрозофилами. Сначала мышей подвергали воздействию вещества, которое обычно повреждает лишь один из 15 тыс. генов, содержащихся в геноме мыши. При этом повреждения происходят случайным образом, поэтому заранее не известно, какой ген окажется поврежден. Выведенным мышам дают ряд заданий, чтобы проверить, у кого из них изменение повлияло на способности. Для этого необходимо разводить мышей в течение ряда поколений, поэтому прямая генетика требует немалых затрат времени и других ресурсов, но имеет важное преимущество объективности. Этот способ отбора генов не предполагает проверки никаких гипотез, поэтому влияние субъективных факторов в нем сведено к минимуму.

Революционный метод рекомбинантной ДНК позволил биологам разработать требующие меньших затрат, в том числе времени, методы обратной генетики. Она позволяет извлекать из генома мыши определенный ген или, напротив, вводить его в геном и изучать, как это влияет на синаптические изменения и обучение. В обратной генетике больше субъективности, потому что она предполагает проверку гипотез, например задействованы ли определенный ген и кодируемый им белок в определенной форме поведения.

Обратная генетика мышей стала возможной благодаря двум методам модификации отдельных генов. Первый — трансгеноз, позволяющий вводить чужеродный ген, так называемый трансген, в ДНК яйцеклетки мыши. После оплодотворения яйцеклетки трансген становится частью генома будущего мышонка. Затем взрослых трансгенных мышей разводят, чтобы получить генетически чистую линию, у всех представителей которой экспрессируется этот трансген. Во втором методе генетической модификации мышей задействовано выключение («нокаут») генов в мышином геноме. Этого добиваются посредством введения в ДНК мыши особого фрагмента генетического материала, который делает определенный ген нефункциональным и тем самым обеспечивает отсутствие белка, кодируемого данным геном, в организме мыши.

Мне становилось ясно, что эти достижения генной инженерии делали мышей превосходными подопытными животными для выявления генов и белков, ответственных за размыв формы долговременной потенциации. Теперь можно было узнать, как эти гены и белки связаны с формированием пространственной памяти. Хотя мыши — сравнительно простые млекопитающие, их головной мозг анатомически похож на человеческий, а гиппокамп у них, как и у людей задействован в формировании памяти о местах и предметах. Кроме того, мыши размножаются намного быстрее, чем более крупные млекопитающие, такие как кошки, собаки, обезьяны и люди. Благодаря этому большие популяции мышей с одинаковыми генами, в том числе трансгенами или нокаутными генами, можно получать за несколько месяцев.

Новые, революционные экспериментальные методы имели серьезные последствия для биомедицинских исследований. Почти каждый ген человеческого генома представлен несколькими вариантами, так называемыми аллелями, которые по-разному распределены среди людей. Генетические исследования неврологических и психических расстройств человека позволили выявить некоторые аллели, ответственные за поведенческие различия между здоровыми людьми, а также аллели, лежащие в основе многих неврологических заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, раннее развитие болезни Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона и некоторые формы эпилепсии. Возможность вводить болезнетворные аллели в геном мыши и исследовать, какие нарушения они вызывают в мозгу и поведении, произвела революцию в неврологии.

Последней из причин, побудивших меня заняться исследованиями генетически модифицированных мышей, стал приход в нашу лабораторию нескольких талантливых постдоков, среди которых были Сет Грант и Марк Мейфорд. Грант и Мейфорд намного лучше меня разбирались в генетике мышей и сильно повлияли на направление наших исследований. Грант был инициатором начала работ с генетически модифицированными мышами, а критическое мышление Мейфорда сыграло важную роль впоследствии, когда мы начали совершенствовать методы, которые использовали для первого поколения экспериментов по генетике поведения мышей.

Первые использованные нами методы получения трансгенных мышей сказывались на всех без исключения клетках в организме мыши. Нам нужно было найти способ ограничить свои генетические манипуляции мозгом, а именно теми его участками, в которых формируются нейронные цепи, обеспечивающие работу эксплицитной памяти. Мейфорд разработал приемы, позволяющие ограничить экспрессию внедренных в геном мыши генов определенными участками мозга. Он также разработал метод, позволяющий управлять временем экспрессии генов в мозгу, включая и выключая их. Эти достижения начали очередной этап нашей работы и нашли широкое применение у других исследователей. Они остаются краеугольными камнями современных методов изучения поведения на генетически модифицированных мышах.

Первые попытки связать долговременную потенциацию с пространственной памятью были предприняты в конце восьмидесятых. Ричард Моррис, физиолог из Эдинбургского университета, показал, что, блокируя NMDA-рецепторы определенными препаратами, можно блокировать и долговременную потенциацию, тем самым мешая работе пространственной памяти. Мы с Грантом в Колумбийском университете и Сусуму Тонегава и его постдок Алсино Силва в Массачусетском технологическом институте независимо друг от друга сделали еще один важный шаг вперед в этом направлении. Нашим группам удалось получить генетически модифицированных мышей по одной линии, у которых отсутствовал важный белок, который, как считалось, задействован в долговременной потенциации. Затем мы исследовали, как изменилось поведение генетически модифицированных мышей по сравнению с нормальными мышами.

Мы проверяли способности этих мышей, наблюдая за тем, как они выполняют некоторые стандартные задания по ориентации в пространстве. Например, мы помещали мышь в центр большой, хорошо освещенной круглой площадки белого цвета, вдоль края которой расположены сорок отверстий. Только одно из этих отверстий вело в убежище. Площадка находилась в небольшом помещении, все стены которого были украшены непохожими друг на друга узорами. Мыши не любят открытое пространство, особенно хорошо освещенное. В таких условиях они чувствуют себя беззащитными и пытаются скрыться в убежище. Единственный способ бежать с этой платформы состоял в том, чтобы найти отверстие, ведущее в убежище. Рано или поздно мышь обучается находить это отверстие, запоминая пространственную связь между ним и узорами на стенах помещения.

Пытаясь скрыться, мышь использует одну за другой три стратегии: случайную, последовательную и пространственную. Любая из этих стратегий позволяет найти нужное отверстие, но они сильно отличаются друг от друга по эффективности. Вначале мышь суется в разные отверстия в случайном порядке и быстро обучается тому, что это неэффективная стратегия. Затем она начинает последовательно изучать отверстия одно за другим, пока не находит путь в убежище. Данная стратегия лучше, но и она не оптимальна. Обе эти стратегии не относятся к пространственным: для их использования мышам не требуется иметь внутреннюю карту пространственного устройства окружающей среды, записанную в мозгу (не требуется и участие гиппокампа). Наконец мышь начинает использовать пространственную стратегию, в которой задействован гиппокамп. Она запоминает, на какую стену смотрит искомое отверстие, и направляется к нему по прямой, ориентируясь по узорам на стенах. Большинство мышей быстро проходит первые две стратегии и вскоре обучается использовать пространственную.

Затем мы сосредоточились на изучении долговременной потенциации в одном проводящем пути гиппокампа — так называемых коллатералях Шаффера. Ларри Сквайр из Калифорнийского университета в Сан-Диего обнаружил, что повреждения этого пути вызывают нарушения памяти, похожие на те, которыми страдал Г. М. (пациент Бренды Милнер). Мы установили, что, нокаутируя определенный ген, который кодирует белок, играющий важную роль в долговременной потенциации, можно нарушить синаптическое усиление в коллатералях Шаффера. Кроме того, с этим генетическим нарушением у мышей было связано нарушение пространственной памяти.

Лаборатория в Колд-Спринг-Харбор каждый год проводит симпозиум, посвященный какой-то одной важной биологической теме. Темой симпозиума 1992 года была поверхность клеток, но, поскольку наши исследования и исследования Сусуму Тонегавы сочли достаточно интересными, ради нас решили устроить отдельную секцию, не связанную с поверхностью клеток, чтобы мы могли выступить на ее заседании. Мы с Тонегавой представили наши эксперименты, посвященные тому, как нокаутирование единственного гена подавляет и долговременную потенциацию в одном из проводящих путей гиппокампа, и пространственную память. Эти наблюдения были пределом того, что было известно не тот момент о связи долговременной потенциации с пространственной памятью. Вскоре после этого мы оба сделали еще один шаг вперед, изучив связь долговременной потенциации с пространственной картой окружающей среды, представленной в гиппокампе.

До этого симпозиума мы с Тонегавой были немного знакомы. В семидесятых годах ему удалось разобраться в генетических основах разнообразия антител. Это был выдающийся вклад в иммунологию, за который в 1987 году он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Оставив позади это достижение, он решил обратиться к нейробиологии и завоевывать новые научные миры. Он дружил с Ричардом Акселем, который и предложил ему встретиться со мной.

В 1987 году, когда Тонегава пришел ко мне, его особенно интересовала проблема сознания. Я старался поддержать его интерес к нейробиологии, но в то же время убедить отказаться от идеи изучать сознание, потому что для того времени эта область была слишком сложной и неопределенной, чтобы применять к ней молекулярный подход. Сусуму уже использовал генетически модифицированных мышей для изучения иммунной системы, поэтому намного более естественным и практичным выбором для него было обратиться к исследованию обучения и памяти, что он и сделал, когда в его лабораторию пришел Силва.

После 1992 года многие другие исследовательские группы тоже получили результаты, аналогичные нашим. Хотя связь между нарушениями долговременной потенциации и проблемами с пространственной памятью и не наблюдается в некоторых довольно важных случаях, тем не менее эта связь оказалась подходящим предметов исследования для изучения молекулярных механизмов долговременной потенциации и роли этих механизмов в работе памяти.

Мне было известно, что у мышей пространственная память, как и имплицитная память аплизий и дрозофил, состоит из двух компонентов: кратковременной памяти, которая не требует синтеза белков, и долговременной, которая требует его. Теперь мне хотелось выяснить, задействованы ли в формировании эксплицитной кратковременной и долговременной памяти особые синаптические и молекулярные механизмы. У аплизии формирование кратковременной памяти требует кратковременных синаптических изменений, вызываемых исключительно работой вторичных посредников. Для долговременной же требуются более устойчивые синаптические изменения, также основанные на изменениях в экспрессии генов.

Мы с коллегами исследовали срезы гиппокампа генетически модифицированных мышей и обнаружили, что в каждом из трех главных проводящих путей гиппокампа долговременная потенциация включает две фазы, похожие на фазы долговременного усиления связей у аплизии. Однократное воздействие серией электрических разрядов вызывает непродолжительную раннюю фазу долговременной потенциации, которая длится всего час, два или три и не требует синтеза новых белков. Реакция нейронов на подобную стимуляцию была именно такой, как ее описывал Роджер Николл: в постсинаптической мембране активировались NMDA-рецепторы, обеспечивая приток ионов кальция в постсинаптическую клетку. Кальций при этом действует как вторичный посредник, запуская долговременную потенциацию за счет усиления реакции AMPA-рецепторов на глутамат и стимуляции встраивания новых AMPA-рецепторов в постсинаптическую мембрану. Кроме того, в ответ на стимуляцию определенного характера постсинаптическая клетка может посылать сигнал в обратную сторону, в пресинаптическую клетку, чтобы та выделяла больше глутамата.

Многократное воздействие сериями электрических разрядов приводит к развитию поздней фазы долговременной потенциации, которая длится больше суток. Мы установили, что по своим свойствам эта фаза, которую детально еще никто не изучал, похожа на долговременное усиление синаптических связей у аплизии. В обоих случаях важную роль играют модуляторные интернейроны, которые у мышей служат для преобразования кратковременных гомосинаптических изменений в долговременные гетеросинаптические. У мышей эти нейроны выделяют дофамин — нейромедиатор, с помощью которого в мозгу млекопитающих работают механизмы внимания и подкрепления. Дофамин в гиппокампе мышей, подобно серотонину у аплизий, связывается с рецептором, который активирует фермент, повышающий концентрацию циклического АМФ. При этом существенно, что повышение концентрации циклического АМФ в гиппокампе мышей происходит в том числе и в постсинаптических клетках, в то время как у аплизии концентрация этого вещества повышается только в пресинаптических сенсорных нейронах. Циклический АМФ в обоих случаях активирует протеинкиназу А и другие протеинкиназы, что приводит к активации CREB-белка и включению структурных генов.

Одним из необычных открытий, сделанных нами ходе исследований памяти у аплизии, было обнаружение подавляющего работу памяти гена, кодирующего белок CREB-2. Подавление экспрессии этого гена у аплизии ускоряет увеличение силы синапсов и повышение их числа, связанные с долговременным усилением синаптических связей. Наши эксперименты на мышах показали, что у них подавление этого и других аналогичных генов, угнетающих работу памяти, усиливает долговременную потенциацию в гиппокампе и улучшает пространственную память.

В ходе этой работы у меня снова появилась приятная возможность сотрудничать со Стивеном Зигельбаумом. Нам нужно было разобраться с одним ионным каналом, подавляющим синаптическое усиление, особенно в некоторых дендритах. Мы с Олденом Спенсером уже исследовали эти дендриты в 1959 году и пришли к выводу, что потенциалы действия в них возникают в ответ на активацию перфорантного пути, ведущего из энторинальной коры в гиппокамп. Мы со Стивом вывели мышей, у которых не работал ген данного ионного канала. Оказалось, что у этих мышей долговременная потенциация в ответ на стимуляцию перфорантного пути существенно усилена, отчасти за счет дендритных потенциалов действия. В результате эти мыши отличались блестящими способностями: пространственная память у них была намного лучше, чем у нормальных мышей!

Кроме того, мы с коллегами выяснили, что для работы эксплицитной памяти в мозгу млекопитающих, в отличие от имплицитной у аплизий и дрозофил, требуется участие нескольких регуляторных генов в дополнение и генам CREB-белков. Хотя это требует уточнения, судя по всему, включение определенных генов у мышей тоже вызывает в анатомические изменения, а именно отрастание новых синаптических связей.

Несмотря на существенные поведенческие различия между имплицитной и эксплицитной памятью, некоторые механизмы работы имплицитной памяти, возникшие сотни миллионов лет назад у беспозвоночных, почти не изменились в ходе эволюции и легли в основу работы эксплицитной памяти в мозгу позвоночных. Хотя великий нейрофизиолог Джон Экклс и убеждал меня в начале моей научной карьеры не бросать исследования несравненного мозга млекопитающих ради работы с безмозглыми морскими слизнями, сегодня уже ясно, что существует целый ряд ключевых молекулярных механизмов работы памяти, общих для всех животных.