Особенности иконографии и стилистики, а также высокое художественное качество этого чудотворного образа позволяют датировать памятник 80–90-ми годами XIV в. и связывать его с Деисусом Благовещенского собора Московского Кремля, автора которого отождествляют с Феофаном Греком или с неким мастером его круга. Икона двусторонняя: на лицевой стороне – образ Богоматери с Младенцем, на обороте – Успение Пресвятой Богородицы. В нижней части иконной доски находится углубление для святых мощей, закрытое воском после реставрации.

Первое упоминание об этой иконе встречается в летописях середины – второй половины XVI в. В царствование Иоанна IV великий князь Димитрий Иоаннович стал именоваться Донским, так же стали называться и заложенная им перед Куликовской битвой церковь Успения в Коломне (1379–1382), и хранившаяся в ней древняя чтимая икона Богоматери. Накануне выступления против Казанского ханства (1552) Иоанн IV молился в Успенском соборе Коломны перед образом «Пречистыя, иже на Дону была с преславным великим князем Дмитрием Ивановичем». Победа способствовала прославлению иконы, получившей статус государственной святыни, перенесенной в придворный Благовещенский собор Московского Кремля. В Ливонской войне Донская икона также была заступницей и покровительницей православных воинов. В Полоцкий поход 1563 г. Иоанн IV взял с собой «непобедимую воеводу чюдотворную икону Пречистыя Богородицы, сиречь Донскую, преже того стояла в соборном храме Успения Пречистыя на Коломне». В 1591 г. царь Феодор Иоаннович молился в походной церкви перед Донской иконой о спасении Москвы от нашествия хана Казы-Гирея. В 1591 г. в память о чудесном заступничестве Богоматери на месте походной церкви был основан Донской иконы Божией Матери московский монастырь. Для него сделали список чудотворной иконы – «подобие пречюдные иконы Пречистыя Богородицы Донския».

В XVII в. Донская икона оставалась особо чтимой святыней, к ней как к главной заступнице от «неверных» обращались при возникновении опасности вражеского нашествия. В 1646 г., во время нападения крымских татар на южнорусские земли (Украину), царь Алексей Михайлович, подобно Феодору Иоанновичу, молился перед Донской иконой, и нападение «агарян» было отбито. В честь этого события были совершены праздничные службы и крестные ходы с чудотворной Донской иконой в Донской монастырь, а в 1649–1660 гг. установлены ежегодные крестные ходы в день празднования этой святыни. Во время больших крестных ходов Донскую икону выносили вместе с чудотворной Владимирской иконой Божией Матери.

В период войн с Турцией в XVII в. – Чигиринские походы (1677–1678) и Крымские походы князя В. В. Голицына (1687, 1689) – почитание Донской иконы усилилось. В 1692 г. архимандрит Донского монастыря Антоний написал предисловие к вкладной книге монастыря «Слово известное всем благочестивым христианам», в котором, основываясь на сведениях «Повести о честнем житии царя и великаго князя Феодора Ивановича», подробно изложил историю чудесного избавления Москвы от Казы-Гирея, а также дополнил рассказ о победе на Куликовом поле актуальным для XVII в. эпизодом о донских казаках, пришедших на помощь православному воинству и принесших в дар Донскую икону Божией Матери. Автор «Повести от древних летописных историй о чюдотворном образе Пресвятыя Богородицы, нарицаемыя Донскиа, откуда и коих лет прославися и како зде во граде Коломне обретеся», созданной, вероятно, в Коломне, описывал, как перед Куликовской битвой великий князь Димитрий слышал «близ града Коломны глас», предрекший ему заступничество Богоматери, а на Дону к нему присоединились казаки, преподнесшие икону Божией Матери, поставленную им после победы в кремлевском храме Благовещения. «Познав силу» слышанного «гласа», великий князь «повеле иконописцу образ Пресвятыя Богородицы Донския преписати противу того новый и послати в град Коломну и в церкви соборной поставити». Эта часть рассказа основана на исторических фактах, относящихся не к XIV, а к XVI в.: после перенесения иконы в Москву Иоанном IV в Успенском соборе Коломны действительно остался ее список, отмеченный в писцовой книге города 1577–1578 гг.

С воцарением Петра I обороне южных границ России стало придаваться большее значение; почитание Донской иконы вновь возросло. С ее заступничеством связывали взятие Азова в 1696 г. В конце XVII – начале XVIII в. было составлено несколько слов и поучений на празднование чудотворной Донской иконы, самые известные из которых – «Поучение» святителя Димитрия Ростовского и «Слово» Стефана (Яворского), написанное по случаю взятия Нарвы Петром I в 1704 г.; появились повести, близкие по содержанию к «Слову» архимандрита Антония. В одной из них (написана на бумаге XIX в.) излагается версия о принесении иконы в Благовещенский собор великим князем Димитрием Иоанновичем непосредственно «из Дону».