9. Пептидная дактилоскопия

В предыдущей главе я рассказывал о различных попытках теоретического разрешения проблемы кода. В этой главе я расскажу об экспериментальных подходах. Вопрос оставался по сути тем же: управляют ли гены (ДНК) синтезом белков? И если да, то как?

В наши дни представляется вполне очевидным, что аминокислотная последовательность белка определяется генетически, и в первую очередь последовательностью оснований в цепочке ДНК (или РНК), но это не всегда было очевидно. После открытия двойной спирали эта идея вызывала больше симпатий, так что мы с Джимом стали принимать ее как должное. На следующем этапе требовалось доказать, что ген и белок, который он кодирует, коллинеарны. То есть что последовательность оснований в этом отрезке нуклеиновой кислоты пошагово соответствует последовательностям аминокислот в том белке, который он кодирует, подобно тому как последовательность, записанная азбукой Морзе, коллинеарна соответствующему тексту на английском.

В то время прямое секвенирование как ДНК, так и РНК представлялось безнадежной затеей, но мы полагали, что при благоприятных условиях можно задать набор мутаций в пределах одного гена, используя обычные генетические методы. Поскольку генетические расстояния были, по-видимому, невелики, ожидаемая частота рекомбинаций должна была быть существенно ниже, чем та, с которой обычно имеют дело генетики. Из этого следовала необходимость изучить большое количество потомства, а значит, нужно было использовать какой-то микроорганизм, например, бактерию или вирус.

Рассортировав мутантные последовательности, на следующем этапе можно было бы соотнести изменения в аминокислотах с каждой мутацией. Хотя секвенирование белковой цепочки тогда оставалось еще трудоемким, Фред Сэнгер продемонстрировал, что оно возможно, и мы ожидали, что, если взять белковую молекулу малых размеров, эта задача не окажется непосильной.

Однажды летом 1954 г., сидя на траве в Вудс-хоул, я изложил эти идеи польскому генетику Борису Эфрусси. Борис, работавший тогда в Париже, особенно интересовался генами дрожжей, которые как будто находились вне клеточного ядра. Теперь мы знаем, что такие цитоплазматические гены принадлежат ДНК митохондрий клетки, но в ту пору о них было известно лишь то, что они ведут себя иначе, чем ядерные гены. Борис разозлился. «С чего вы взяли, – осведомился он, – что аминокислотная последовательность кодируется не цитоплазматическим геном? Может быть, единственная функция ядерных генов в том, чтобы задавать нужную укладку белка?»

Может быть, Борис и сам в это не верил (я не поверил точно), но его вопрос заставил меня осознать, что сперва нам нужно продемонстрировать влияние единичной мутации в ядерном гене на аминокислотную последовательность белка, которую он кодирует, – возможно, изменение всего лишь одной аминокислоты. По возвращении в Кембридж я решил, что этим и нужно заняться на следующем этапе.

Какой организм использовать, какой белок изучать, было непонятно. Вскоре к нам в Кавендишскую лабораторию пришел работать Вернон Инграм. Его основная задача состояла в том, чтобы добавлять тяжелые атомы к молекулам гемоглобина или миоглобина для облегчения работ с дифракцией, но вместе с ним мы решили подступиться к генетической проблеме. Мы догадались, что на начальном этапе нам не нужно полное картографирование гена. Все, что нам требовалось, – чтобы генетической информации хватило для доказательства того, что мутация наследуется по-менделевски и, следовательно, относится к ядерному гену. Не требовалось и определять местоположение измененной аминокислоты в белковой последовательности. Нужно было лишь продемонстрировать, что в последовательности имеет место изменение, вызванное мутацией. Мы считали, что это облегчит задачу, поскольку в таком случае от нас требовалось всего лишь изучить аминокислотный состав белков. Если молекула белка была достаточно небольшой, при везении мы могли бы установить и совсем малое изменение, на уровне единственной аминокислоты.

Как наиболее легкодоступный для работы белок, мы выбрали лизоцим. Лизоцим – фермент, впервые описанный Александром Флемингом, первооткрывателем пенициллина; молекула его небольшая, по свойствам основная (то есть положительно заряженная). Флеминг доказал, что этот фермент присутствует в слезах и что его много в яичном белке. Он лизирует (разрушает) определенный класс бактерий и в обоих случаях служит защите от инфекции. Одна из бактерий к нему особенно чувствительна и потому может использоваться как тест на присутствие этого белка.

Основным объектом наших опытов был яичный белок, но мы пробовали работать и с человеческими слезами. Каждое утро, когда я приходил в лабораторию, лаборантка брала образец моих слез. Не будучи актером, я не мог так запросто заплакать по заказу, поэтому лаборантка подносила мне к глазу кусочек сырого лука. Я склонял голову набок, чтобы слеза не утекла в нос, и лаборантка ловила ее пастеровской пипеткой, когда она стекала с другого уголка глаза. И все равно было трудно получить больше одной-двух капель, хотя я обнаружил, что, если думать о грустном, это помогает. Как ни странно, печальные или трагические события не вызывают у меня непроизвольных слез, зато от хеппи-эндов я реву неудержимо. Допустим, невеста в финале торжественно шествует к алтарю под ликующие звуки органа. Я буду обливаться слезами, при этом сгорая от стыда.

Действие одной-единственной слезы поразительно. Слабая взвесь бактерий, которую мы использовали, на вид достаточно мутная, хотя и не такая густая, как молоко. Добавьте одну слезу, взболтайте пробирку, и в одно мгновение взвесь станет совершенно прозрачной. Все бактерии лизированы, поэтому резко упало рассеяние света, из-за которого жидкость выглядела мутной. Разумеется, мы использовали более точные количественные оценки, но в основе наших тестов лежало по существу то же явление.

Поскольку у куриного лизоцима сильный положительный заряд, в отличие от всех других белков яичного белка, можно кристаллизовать его в самом яичном белке, без последующей очистки. Биохимика поражает вид кристаллов, сидящих в загустевшем, клейком яичном белке. По этой же причине лизоцим можно было достаточно легко изолировать с помощью простейшей ионообменной колонки, которую как раз тогда разработали для фракционирования белков.

Я был бы рад похвалиться тем, что мы обнаружили мутантный ген, но на самом деле у нас ничего не вышло. Мы исследовали лизоцим довольно примитивными методами, рассматривая, по сути, его заряд и то, как он поглощает ультрафиолет, однако нам с ходу удалось показать, что куриный лизоцим отличается от лизоцима цесарок, а оба они, в свою очередь, – от лизоцима моих слез. Хотя мы изучили с десяток пород кур, любезно предоставленных здешним специалистом по генетике домашней птицы, и общим счетом около сотни яиц, мы так и не обнаружили никакой разницы между ними. Мы проанализировали слезы нескольких сотрудников лаборатории, но у всех они были похожи. Я захотел взять для анализа слезы моей младшей дочки Жаклин, которой тогда было два годика, но Одилия воспротивилась. Как! Использовать ее бесценное чадо для опытов! Мне было строго-настрого запрещено даже пытаться.

Наверное, мы бы продолжали в том же духе, но тут наступил прорыв. Макс Перуц занимался гемоглобинами, в том числе человеческим. За несколько лет до того Гарви Итано и Лайнус Полинг продемонстрировали, что гемоголобин человека, страдающего серповидноклеточной анемией, при электрофорезе ведет себя не так, как нормальный гемоглобин. Полинг верно определил, что это заболевание генетическое. Один из его коллег в Калифорнийском технологическом институте вычислил аминокислотный состав и сообщил о том, что различий между здоровым гемоглобином и гемоглобином при серповидноклеточной анемии нет. Это был дурно сформулированный вывод. Он имел в виду, что не смог заметить достоверной разницы в составе, но молекулы гемоглобина довольно крупные, так что при его приблизительной методике одну-единственную аминокислотную замену можно было запросто упустить.

Сэнгер изобрел метод, который он назвал пептидной дактилоскопией (fingerprinting proteins). Он разлагал белок с помощью фермента (трипсина), разрезающего полипептидную цепочку строго в определенных местах. Небольшое количество фрагментов пептидной цепи, полученное таким образом, подвергалось затем двумерной бумажной хроматографии, чтобы рассортировать их и разложить на бумаге. Вернон догадался, что это и есть тот метод, которого ему не хватало, чтобы отловить мелкие изменения в молекуле белка. Максу повезло получить гемоглобин больного серповидноклеточной анемией, и он поделился им с Верноном для анализов. К его радости, «отпечатки» пораженного и здорового гемоглобина отличались на одну позицию в одной из субъединиц белка.

Вернон сумел выделить измененный пептид, определить его последовательность и доказать, что разница вызвана заменой единственной аминокислоты. Валин заменял глутаминовую кислоту. Помнится, он сомневался, не две ли аминокислоты подверглись замене. Мы с Джимом в ту пору были менее сдержанны и не поверили. «Попробуйте еще раз, Вернон, – сказали мы ему, – вот увидите, замена всего одна». Так и оказалось.

Этот результат был неожиданным в двух отношениях. Серповидноклеточная анемия – болезнь, при которой мутантный гемоглобин, отдавая кислород в сосудах, образует кристаллы внутри эритроцитов (красных кровяных телец). От этого эритроцит часто рвется, поэтому больные испытывают хронический недостаток гемоглобина в крови и часто умирают, не дожив до двадцати. И это смертоносное воздействие оказывала крошечная замена в единственном из множества генов организма (теперь известно, что это замена всего одного основания, то есть нуклеотида). В сущности, испорчены всего две молекулы – одна унаследована от отца, вторая от матери. Как может такое малюсенькое изменение погубить чью-то жизнь? Все дело в каскаде нарастания. Каждый дефектный ген копируется много-много раз, ведь каждая клетка тела должна воспроизвести себя. Стало быть, у клеток – предшественников эритроцитов каждый ген копируется множество раз на матричную РНК, а каждая матричная РНК запускает синтез множества дефектных молекул белка. Крошечный дефект в расположении атомов ширится и ширится, пока в организме больного не накапливается много дефектного белка – достаточно, чтобы при неблагоприятных условиях вызвать смерть.

Второй неожиданный аспект открытия был научным. Как ни странно, до тех пор большинство генетиков и специалистов по химии белков не задумывались всерьез о том, что их области имеют что-либо общее. Конечно, отдельные прозорливцы, наподобие Германна Мюллера, догадывались об этом, но каждая область занималась собственными задачами, имея весьма мало представления о другой. Примерно в это время я случайно познакомился с Фредом Сэнгером – кажется, в поезде по пути в Лондон. Он сказал, что он и его небольшая команда решили немного ознакомиться с генетикой, о которой до сего времени они практически ничего не знали – разве только то, что она существует.

Я организовал еженедельные вечерние семинары у себя в гостиной в «Золотой спирали». Сидни Бреннер и Сеймур Бензер согласились ими руководить. Первый семинар я помню живо. Сидни явился немного пораньше, чем все остальные. Я спросил у него, о чем он собирается говорить. Он сказал, что, по его мнению, стоит начать с Менделя и гороха. Я заметил, что тема, пожалуй, несколько устарела для нашего времени. Почему бы не начать с гаплоидных организмов (тех, у которых только одна копия набора генов), наподобие бактерий, а не с гороха, мыши или человека, которые диплоидны (то есть имеют две копии в каждой клетке) и потому устроены сложнее? Сидни согласился. Он прочел блестящую лекцию, в основном о различии между генотипом и фенотипом, иллюстрируя примерами бактерий и вирусов-бактериофагов. Меня она особенно впечатлила, ведь я знал, что он выступает без подготовки.

Полагаю, это образцовый пример того, как надо возводить мост между двумя различными, но несомненно связанными областями знания (в наше время это могут быть, например, когнитивная психология и нейробиология). Не думаю, что аргументированные возражения, сколь угодно хорошо выстроенные, принесут пользу. Они могут в лучшем случае пробудить понимание, что, возможно, какая-то связь имеется. Так, многих генетиков было непросто убедить в необходимости изучать химию белков только потому, что кое-кто из умных людей считал, что генетика должна двигаться в этом направлении. Они считали (как в наши дни функционалисты), что логика их предмета не зависит от знания всех биохимических тонкостей. Генетик Р. А. Фишер как-то сказал мне, что нужно объяснение, почему гены располагаются подобно бусинам на ниточке. Похоже, до него вообще никогда не доходило, что гены сами и образуют ниточку!

По-настоящему понять связь двух областей знания помогает какой-либо новый яркий результат, который явно и эффектно эту связь демонстрирует. Один хороший пример стоит вагона теоретических доводов. Тогда на мост между двумя дисциплинами быстро набегает толпа исследователей, жаждущих применить новый подход.