2018. Криоэлектронная микроскопия Дебюше, Франка и Хендерсона

Лауреатами Нобелевской премии по химии за 2017 год стали работающий в швейцарском Университете Лозанны Жак Дюбоше, профессор Колумбийского университета в Нью-Йорке Йоахим Франк и представитель британского Кембриджа Ричард Хендерсон. Поводом для присуждения награды стала «…разработка методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения структур биомолекул в растворе…». Пресс-релиз Нобелевского Комитета сообщал, что метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру, позволяя заполнить множество пробелов в «карте биохимии».

Некоторые интернет-ресурсы прямо в день объявления о лауреатах Премии отреагировали броскими заголовками, как, например: «Нобелевскую премию по химии дали за мгновенную заморозку биологических образцов». Так что же важно в этом методе – сам процесс заморозки, адаптация электронной микроскопии к нуждам биохимии, сочетание методов или что-то иное? Давайте попробуем разобраться.

В 1968 году была опубликована заключительная часть научно-популярной трилогии физика Георгия Гамова «Мистер Томпкинс в стране чудес». Она называлась «Мистер Томпкинс внутри самого себя. Приключения в новой биологии». В этой книге рассказывалось, как мистер Томпкинс в сопровождении своего семейного врача изучает клеточное строение своего тела и плавает по своим кровеносным сосудам. Рассказывая о деталях строения клеток и их органоидов, экскурсовод пояснял Томпкинсу, что вся эта информация получена с помощью электронного микроскопа.

Для читателей научно-популярного труда Гамова становилось очевидным, что электронная микроскопия уже позволяет вести изучение биологических тканей и отдельных клеток, допуская получать изображения биологических объектов с невиданной до определенного времени четкостью и детализацией. Однако в отличие от Мистера Томкинса ещё лет десять назад ученым оставалось только мечтать о возможности применения электронного микроскопа для изучения атомно-молекулярной архитектуры биологически активных молекул. Фактически, эта мечта стала былью совсем недавно, лишь спустя четыре десятка лет после углубления Мистера Томпкинса в самого себя. То, что сейчас мы действительно в состоянии применять электронную микроскопию в биохимии, практически полностью является заслугой лауреатов Нобелевской премии по химии 2017 года Жака Дюбоше, Иоахима Франка и Ричарда Хендерсона. Именно благодаря их открытиям и разработкам стало возможным установление всех деталей структуры не образующих монокристаллы биомолекул непосредственно в растворе с помощью криоэлектронной микроскопии.

Путь электронной микроскопии в биохимию не был усыпан розами. Так, вскоре после того, как в 1931 году Эрнст Август Фридрих Руска продемонстрировал принцип работы электронного микроскопа – того устройства, которое принесло ему Нобелевскую Премию по физике 1986 года, венгерский физик Ладислав Мартон написал статью, в которой утверждал, что какой бы интерес не представляло собой новое устройство, шансы его на применение в изучении биологических материалов в настоящем его виде равны нулю из-за того, что «…интенсивная бомбардировка живых клеток электронами будет приводить к их разрушению…» (Nature, 1934, 133, 911–911; DOI:10.1038/133911b0).

Возможно, мы вполне имеем право назвать Мартона одним из тех учёных, благодаря работам которых и стала возможной разработка метода, а перед Дюбоше, Франком и Хендерсоном встала дополнительная, но, согласитесь, приятная задача – подготовка Нобелевской лекции. Дело в том, что именно в том письме в редакцию Nature 1934 года Мартон предложил возможные методы решения адаптации электронной микроскопии для исследования биологических объектов – их заморозка или применение подхода, похожего на ещё на разработанный в те годы метод негативного контрастирования. Тем не менее, предложенные Мартоном подходы к решению в то время можно было назвать ничем иным, как академическим теоретизированием.

Ещё одна проблема, путей решения которой Мартон не видел – как бороться с неизбежным испарением воды из биологического образца в условиях разрежения рабочей камеры электронного микроскопа и связанным с этим испарением изменением форм изучаемых белков и нуклеиновых кислот. Невооружённым глазом было видно и другие проблемы – биологические объекты могли отличаться крайне низкой контрастностью изображения при прохождении через них электронов с высокой энергией; энергию электронного пучка нельзя было делать очень высокой для предотвращения повреждения образца уже на химическом уровне организации; для предотвращения вторичного рассеивания электронов образцы должны были быть не просто тонкими, а представляющими собой идеальный монослой, состоящий из изучаемых объектов. Также было очевидно, что для записи изображений нужно использовать быстрые детекторы – изучаемые биомолекулы могли менять свою форму или даже перемещаться из-за незначительного дрейфа температуры или взаимодействия с бомбардирующими их электронами.

Необходимость изучать низкоконтрастные биологические материалы с использованием электронов, обладающих как можно меньшей энергией, стимулировала разработку новых подходов к приготовлению и подготовке биологических материалов для анализа. Первым методом, применение которого позволило значительно увеличить качество получаемого изображения, был метод негативного контрастирования, разработанный в 1940-х годах и модифицировавшийся следующие два десятка лет после изобретения (J. Applied Physics, 1945, 16, 459-465 DOI: 10.1063/1.1707615; J. Mol. Biol., 1965, 11, 403-423; DOI: 10.1016/S0006-3495(89)82799-7).

Метод негативного контрастирования основан на том, что биологический материал внедряют в тонкую аморфную плёнку соли тяжелого металла (например, фосфата вольфрама), формирующую определенный шаблон вокруг биомолекул. Полученный шаблон рассеивает электроны эффективнее инкапсулированного в него биологического материала, он более устойчив по отношению к повреждению потоком электронов и не дает биологическим молекулам менять форму во время их сушки в вакууме в камере электронного микроскопа.

Негативное контрастирование образцов позволило получать детальную информацию о строении бактерий, вирусов и клеточных органоидов. Однако, при уменьшении масштаба, например, при попытке изучить положение молекул в молекулярных комплексах, можно получить, в лучшем случае, только изображение «конверта», в который помещались биомолекулы; разрешение этого изображения ограничивалось величиной зерна шаблона. Несмотря на изъяны, такой метод подготовки пробы позволил исследователям получить информацию о структуре ряда соединений, правда, в низком разрешении. Разработанные в то время экспериментальные и теоретические подходы, применявшиеся для получения информации о трехмерной структуре объекта с помощью суммирования его двумерных проекций, полученных с помощью электронного микроскопа, заложили основы криоэлектронной микроскопии.

Улучшения в методы исследования биологических объектов с помощью электронной микроскопии внёс в том числе и Аарон Клуг, получивший в 1982 году Нобелевскую премию по химии «…за разработку метода кристаллографической электронной микроскопии и прояснение структуры биологически важных комплексов нуклеиновая кислота – белок…». Он одним из первых пришел к тому, что для уточнения трехмерной структуры объекта, полученного с помощью метода негативного контрастирования, необходимо получать двумерные проекции с различных направлений, что можно организовать, изменяя угол, под которым на образец направляется поток электронов, или проводя анализ большого количества частиц, ориентированных различным образом. В 1960-х годах Клуг применил свои подходы, с помощью электронного микроскопа изучив тонкие кристаллы каталазы (Berichte der Bunsengesellschaft für physikalische Chemie, 1970, 74, 1129-1137; DOI: 10.1002/bbpc.19700741109).

В 1968 году Клуг совместно с Давидом ДеРозье сообщили о первом удачном примере вычисления трехмерной модели биологического объекта на основании информации о двумерных проекциях, полученных с помощью электронного микроскопа. Исследователи изучили хвост бактериофага T4, он был выбран в качестве объекта исследования благодаря своей спиралевидной симметрии. Для него трехмерную модель можно было построить, анализируя лишь одну двумерную проекцию, которая давала ровно такую же информацию, которую можно было получить, анализируя хвост вируса под другими углами (Nature, 1968, 217, 130-134; DOI:10.1038/217130a0).

Получение информации о трёхмерной структуре частиц, не обладающей спиралевидной симметрией, требует комбинирования данных от нескольких двумерных проекций этих частиц. В 1970 году Клуг совместно с ДеРозье и Энтони Краутером разработал подход, получивший название подхода общих линий, с помощью которого была определена трехмерная структура икосаэдрических конвертов вирусов (Proc. R. Soc. London., 1970, A 317, 319-340; DOI: 10.1098/rspa.1970.0119). В работе предполагалось, что аналогичный метод можно применить к частицам, не обладающим симметрией, но более эффективные результаты он даёт при анализе симметричных образцов.

Ещё одним шагом к применению электронной микроскопии в биохимии была разработка способов, позволяющих сохранить гидратированное состояние биомолекулы в камере электронного микроскопа, а также определить условия, в которых излучение прибора не разрушало бы анализируемый объект. Для этого Дональд Парсонс разработал конструкции камер электронного микроскопа, в которых поддерживалась влажность и комнатная температура (Science, 1974 186, 407–414; DOI: 10.1126/science.186.4162.407). Эти камеры позволили ему использовать электронную микроскопию для изучения кристаллов фермента-каталазы и найти условия, в которых облучение электронами не оказывает влияние на строение белка.

Также в 1970-е Роберту Глэйзеру удалось количественно оценить степень повреждения кристаллической каталазы и низкомолекулярных органических соединений в результате облучения потоком электронов (J. Ultrastruct. Res., 1971, 36, 466-482; DOI: 10.1016/S0022-5320(71)80118-1). Он же пришёл к выводу о том, что применение для анализа небольших доз электронов будет приводить к необходимости использования большого количества анализируемых объектов, что может увеличить соотношение сигнал-шум. Другими словами, изучение с помощью электронной микроскопии большого количества частиц приведет к тому, что та энергия излучения, которая могла бы повредить небольшое количество изучаемых объектов, будет просто равномерно распределена между большим количеством биомолекул одного и того же типа (J. Mol. Biol., 1975, 94, 425-432; DOI: 10.1016/0022-2836(75)90212-0). Охлаждение объекта исследования считалось ещё одним способом, который одновременно может понизить скорость испарения воды и защитить биологический материал от повреждения электронным пучком. В 1950-60-х годах Умберто Моран изучал возможности заморозки образцов и приготовления чрезвычайно тонких препаратов для их изучения с помощью криоэлектронной микроскопии (Annals of the New York Academy of Sciences, 1960, 85, 689-713; DOI: 10.1111/j.1749-6632.1960.tb49990.x). Однако при охлаждении вода обычно замерзает с образованием мельчайших кристалликов льда, на которых происходит дифракция электронов, в значительной степени искажающая сигналы, полученные при изучении образца, не говоря уже про то, что кристаллики льда могли изменить строение изучаемого объекта. О проблемах, связанных с образованием кристалликов льда при охлаждении клеток было известно ещё с 1940-х годов. Пытавшийся подбирать способы безопасного охлаждения Базиль Люе предлагал снизить негативное влияние холода на биологические образцы за счет ускорения процесса заморозки: быстрая заморозка способствует тому, что при этом вода затвердевает, формируя не кристаллическую, а аморфную твёрдую структуру. В 1960-е годы быстрая заморозка в первую очередь была применена для изучения белков с помощью рентгеноструктурного анализа. Помимо ударной заморозки образованию кристалликов льда препятствовало введение в образец антифризов – сахарозы или глицерина (Acta Crystallogr B, 1970, 26, 998-1004; DOI: 10.1107/S0567740870003485).

Чуть позже Глейзер и Кеннет Тейлор показали, что при быстрой заморозке электронная микроскопия позволяет изучить кристаллы каталазы, получая картинку с разрешением в 3 Å, не прибегая при этом к контрастированию. Доступная в то время технология заморозки позволяла проводить исследования при температуре выше -120°C, при которой уже наблюдается переход от аморфного к кристаллическому льду. Тем не менее, в условиях эксперимента кристаллики льда не образовывались, причиной чего исследователи предположили взаимодействие молекул воды с поверхностью белка (Nature 271, 1978, 659-660; DOI:10.1038/271659a0). Тейлор и Глейзер также разработали методы, позволяющие хранить биологические образцы при криогенных температурах, показав, что охлаждение образца позволяет использовать зондирование с помощью электронных пучков большей интенсивности, говоря другими словами – охлаждение образца увеличивает его информационную ёмкость. На какое-то время развитие методов, эксплуатировавших электронную микроскопию в биохимии, прекратилось – до 1990-х годов существенных модификаций методов не предпринималось, казалось, что электронный микроскоп позволяет биохимикам узнать если не всё про биомолекулы, а хотя бы всё то, что позволяла существующая в то время техника.

Однако человек устроен так, что ему всегда хочется большего, и желание получить больше информации об объекте с помощью электронной микроскопии не было исключением. Начало 1990-х годов вполне можно считать вехой в развитии криоэлектронной микроскопии: в 1990 году первый из Нобелиатов по химии 2017 года – Хендерсон – с коллегами впервые продемонстрировал возможность практического применения криоэлектронной микроскопии для получения высококачественных изображений биологических объектов за счет совмещения и усреднения копий изображений, полученных для одного и того же объекта, организованного в двумерный кристалл.

Для своей пионерской работы Хендерсон с коллегами смогли получить качественную информацию о строении бактериородопсина, используя для его исследования сразу несколько электронных микроскопов, расположенных в различных научных центрах и оптимизируя информацию, полученную с каждого устройства (J. Mol. Biol., 1990, 213, 899-929; DOI: 10.1016/S0022-2836(05)80271-2). В ходе исследования был обнаружен ряд технических ограничений, свойственных этим микроскопам, а также обозначены проблемы, связанные с приготовлением образцов. Хендерсон сделал вывод о том, что ни один из электронных микроскопов, использованных в исследовании, не был идеален, предположив тем не менее, что ряд модификаций как принципиального устройства электронных микроскопов, так и подготовки образца для исследования в конечном итоге может превратить криоэлектронную микроскопию в быстрый и обычный метод определения строения биологических препаратов, который, в конечном итоге, может оказаться способным изучать в том числе и ассоциаты биологически активных молекул, не обладающие кристаллической и симметричной структурой. Главной проблемой изучения асимметрических частиц, располагающихся без формирования дальнего порядка, было определение положения и ориентации каждой частицы в исследуемом образце на основании генерируемого этой частицей слабого сигнала по измерению соотношения сигнал-шум, однако решение этой задачи силами компьютерной техники, доступной исследователям в 1990 году, было просто невозможно (J. Struct. Biol. 128, 3-14; DOI: 10.1006/jsbi.1999.4172). За последующее десятилетие подходы, похожие на подходы Хендерсона, были использованы другими группами для получения качественных изображений целого ряда биомолекул, среди которых были светопоглощающий комплекс хлорофилл-белок, тубулиновый димер и аквапорин.

Спустя пять лет после выхода статьи про структуру бактериородопсина, полученную с большим разрешением, Хендерсон представил детальный анализ задач, который требовалось решить для изучения с высоким разрешением не формирующих кристаллические структуры ассоциатов биологически активных молекул (Q. Rev. Biophys., 1995, 28, 171-193; DOI: 10.1017/S003358350000305X). Его выводы сводились к тому, что при применении малоинтенсивного недеструктивного облучения электронами при проведении исследований с помощью электронной микроскопии в присутствии фазового контраста будет возможно определить двумерное положение индивидуальных частиц в плоскости двумерного кристалла и их трёхмерную ориентацию в том, правда, случае, если частицы обладают достаточной молекулярной массой. Выводы Хендерсона были таковы – для биомолекул (и ассоциатов биомолекул) с молекулярной массой больше 50 килодальтон возможно получить образец, содержащий достаточное количество частиц (около 10000 частиц) для усреднения результатов их исследования с помощью электронной микроскопии и определения их строения с атомным разрешением, которое будет составлять ~3 Å. В последующие годы число частиц, необходимых для получения результатов изучения структуры с таким разрешением, постоянно корректировалось в сторону уменьшения, и к началу XXI века Глейзер пришёл к выводу, что минимальное значение молекулярной массы объекта, который можно проанализировать с разрешением в три ангстрема, составляет 20 килодальтон (J. Struct. Biol., 1999, 128, 3-14; DOI: 10.1006/jsbi.1999.4172). Хотя биомолекулы с этим значением молекулярной массы пока еще никому не удалось изучить, и самой тяжелой молекулой, строение которой помог изучить электронный микроскоп, является молекула гемоглобина с молекулярной массой 64 кДа (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099), разрешение, с которым удается изучить строение некоторых молекул, уже составляет величину, меньшую, чем 2 Ангстрема.

Второй из Нобелевских лауреатов 2017 года, Иоахим Франк, еще в середине 1970-х годов стал заниматься фундаментальной проблемой изучения неконтрастированных, некристаллических асимметрических частиц, случайным образом ориентированных в растворе (Ultramicroscopy, 1975, 1, 159-162; DOI: 10.1016/S0304-3991(75)80020-9). Его работа стала основой для дальнейших исследований. Основным способом решить задачу Франк полагал: «…создание условий для выравнивания тех признаков частиц, сигналы которых могут быть четко различимы на фоне значительных шумов…».

В 1977 году Франк с коллегами описал количественный подход, способный обеспечить такое выравнивание с помощью взаимной корреляции сигналов от различных частиц (Ultramicroscopy, 1977, 2, 219-227; DOI: 10.1016/S0304-3991(76)91385-1). Был сделан вывод о том, что существует возможность определить неупорядоченное расположение исследуемых частиц с помощью пучков электронов, мощность которых недостаточна для разрушения самих объектов, и далее выстроить изображение с высоким разрешением, усредняя сигналы, полученные от каждой отдельно взятой частицы. Правомерность такого вывода была продемонстрирована при изучении строения фермента глутаминсинтетазы (Ultramicroscopy, 1978, 3, 283-290; DOI: 10.1016/S0304-3991(78)80038-2).

В принципе, в идеале для некристаллических образцов, состоящих из одинаковых частиц, требовалось не так уж много информации, описывающей их положение в условной плоскости и ориентацию в трёхмерном пространстве – для решения математической задачи, определяющей эти вопросы, требуется определить всего пять параметров. Однако реальные биологические системы отличаются от идеализированной математической модели тем, что образующие их частицы редко бывают однородными по строению, да и содержат примеси. Это приводило к необходимости создания уточнённых математических моделей, тех, которые учитывают неоднородность изучаемой системы и создания алгоритмов, позволяющих сортировать результаты исследования объекта, учитывая то, какие сигналы использовать далее для построения усреднённой картины, а от каких избавляться. В 1981 году Франк с коллегами описал метод, позволяющий сортировать образы частиц на основании их ориентации и особенностей строения (Ultramicroscopy, 1981, 6, 187-194; 10.1016/0304-3991(81)90059-0). В последующих работах Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить зёрна полезной информации, полученной в ходе электронной микроскопии, от неизбежных плевел. В 1981 году он обобщил математические модели в компьютерной программе SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields – Система для Обработки Данных Электронной микроскопии и Связанных областей, первая публикация: Ultramicroscopy, 1981, 6, 343-357; DOI: 10.1016/S0304-3991(81)80236-7). Этот программный пакет для обработки изображений, полученных с помощью электронной микроскопии, существует и обновляется до сих пор (https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html), более того – эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу учёных во всём мире.

Как уже говорилось выше, ожидалось, что быстрое охлаждение избавит электронную микроскопию от целого ряда ограничений и позволит применять её к биомолекулам. Предполагалось, что проблемы, связанные с образованием кристалликов льда, удастся преодолеть с помощью быстрой заморозки, благодаря которой вода будет превращаться не в кристаллическую, а стеклообразную твердую фазу. Однако до 1980-х годов сама принципиальная возможность получения твердой стеклообразной воды была дискуссионной – предполагалось, что скорость охлаждения, необходимая для превращения воды в «правильное» агрегатное состояние, никогда не будет достигнута.

В 1980 году дискуссии на тему стеклообразного состояния воды были закрыты – исследователям удалось заморозить микрометровые капли воды, переведя её в стеклообразное состояние (Nature 288, 1980, 569-571; DOI: 10.1038/288569a0). Годом позже Жак Дюбоше и Алесдер МакДауэлл продемонстрировали метод, позволяющий получить тонкую плёнку твердой некристаллической воды для заморозки образцов и их последующего изучения с помощью электронной микроскопии (J. Microsc., 1981, 124, 3-4; DOI: 10.1111/j.1365-2818.1981.tb02483.x).

Предложенный метод заключался в следующем: воду распыляли на углеродную плёнку, поверх которой была размещена сетка, которую быстро погружали в жидкий этан или пропан с температурой около -190°C, которая поддерживалась за счет охлаждения жидким азотом. Как было показано, тонкий слой стеклообразной твёрдой воды демонстрировал однородное поглощение электронов в процессе изучения криоэлектронной микроскопии. От аморфного состояния воды к кристаллическому можно было перейти, нагревая образец до -140°C. В последующие годы Дюбоше усовершенствовал метод заморозки и приготовления образца для электронной микроскопии, а также описал результаты подробных исследований чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов и молекул ДНК при криогенных температурах (J. Microsc., 1982, 128, 219-237; DOI: 10.1111/j.1365-2818.1982.tb04625.x).

Полностью потенциал метода Дюбоше был оценен в 1984 году, когда его группа опубликовала электронные микрографии суспензий вирусов (Nature, 1984, 308, 32-36; DOI: 10.1038/308032a0). Использованная для получения этих микрографий методика позволяла получать слои воды достаточно тонкие для быстрого превращения воды в стеклообразное состояние, но при этом достаточно толстые для того, чтобы в этом слое мог поместиться монослой биологически активных молекул или молекулярных комплексов в их естественной конформации.

Достижения электронной (в том числе и криоэлектронной) микроскопии последнего десятилетия связаны с улучшением конструкционных элементов электронных микроскопов – сейчас в них применяются новые детекторы, позволяющие уверенно детектировать меньшее количество электронов, новые электронные пушки (источники электронов) и новые камеры, позволяющие практически исключить влияющие на точность микроскопического исследования колебания температуры. Вся эта модернизация, произошедшая уже в XXI веке, позволила и значительно повысить соотношение сигнал-шум, что дает возможность получать более детальные результаты анализа, и увеличить скорость анализа образца, в результате чего отдельные микрографии объектов можно склеить в «фильм» из их жизни. Всё это, как и предполагал Хендерсон в прошлом веке, действительно превратило электронную микроскопию в распространённый и доступный метод исследования, применяющийся повсеместно – от материаловедения до исследования биологических систем. Можно отметить, что настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии как метода для изучения биологических систем начинается с 2012-13 годов и связан с появлением прямых электронных детекторов, применение которых, например, позволило в деталях изучить ионный канал клеточной мембраны TRPV1 (Nature 504, 2013, 107-112: DOI: 10.1038/nature12822). И, наконец, в этом, 2017 году, спустя почти шесть десятилетий после кристаллографического определения строения миоглобина и гемоглобина Джоном Кендрю и Максом Перутцом (именно благодаря этой работе в 1962 году они стали Нобелевскими лауреатами) и спустя четыре года после опубликования первых работ, ставших основой для разработки метода криоэлектронной микроскопии высокого разрешения, электронный микроскоп позволил определить структуру гемоглобина – криоэлектронная микроскопия позволила исследовать одну молекулу гемоглобина, к тому же находящуюся в растворе (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099).

Чем плохи другие методы, например – рентгеноструктурный анализ и ядерный магнитный резонанс?

Известные до криоэлектронной микроскопии и применяющиеся и сейчас методы изучения вещества, в том числе и живого вещества, нельзя назвать плохими, криоэлектронная микроскопия не отменяет, а дополняет их. Более того, как знает любой химик – чем большим количеством методов установлена структура того или иного вещества или системы веществ, тем более надёжными являются результаты исследования. Многие из классических методов позволяют получить исчерпывающую информацию о белках, нуклеиновых кислотах, а в ряде случаев – о молекулярных комплексах, образуемых биологически активными молекулами. Проблема заключается не столько в самих классических методах, сколько в подготовке образцов для исследования. Подготовить пробу для её изучения с помощью криоэлектронного микроскопа несколько проще – можно сказать, что в этом случае способ подготовки пробы заключается в приготовлении водного раствора чистого образца биологически активного вещества

Так, считающийся в настоящий момент главным доказательным методом в химии рентгеноструктурный анализ (РСА) также позволяет получать изображения биологически активных молекул с очень высоким разрешением и значительной степенью детализации – зачастую его сравнивают со способом, позволяющим «сфотографировать» молекулу, определив положение атомов в её составе с точностью до одного ангстрема. Более того, за изучение белков и нуклеиновых кислот методом рентгеноструктурного анализа была присуждена не одна Нобелевская премия. Наиболее известна Нобелевская Премия по физиологии и медицине 1962 года, которую получили Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинсон, которые установили двуспиральное строение ДНК именно с помощью рентгеноструктурного анализа. Любопытно, что в этот же 1962 год лауреатами «химической» Нобелевской премии стали Макс Перуц и Джон Кендрю, использовавшие рентгеноструктурный анализ для изучения строения гемоглобина и других белков. Тем не менее, для того чтобы изучить белок или другую биологически активную молекулу с помощью РСА, необходимо получить кристаллический образец предмета исследования. Бывает, что между определением первичной структуры белка и подготовкой кристаллического образца для определения третичной структуры проходят годы, бывает, что белок просто не кристаллизуется. В ряде случаев в процессе кристаллизации белок принимает форму, значительно отличающуюся от той, которая характерна для него в естественном биологическом окружении. Для изучения биомолекул с помощью криоэлектронной микроскопии не нужно готовить кристаллические образцы, это позволяет и снизить время на исследование, и использовать меньшее количество изучаемого образца. То, что для криоэлектронной микроскопии биосистем нужен только раствор, содержащий образец, а свойства такого раствора (кислотность, солевой фон и т. п.) можно менять перед заморозкой, позволяет применять метод для определения строения биомолекулы в тех условиях, которые недоступны для рентгеноструктурного анализа.

Наиболее распространённый среди химиков, изучающих вещества, для которых пока не удалось получить кристалл для изучения методом РСА, или химиков, изучающих химические процессы в растворах, метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), позволяющий различать атомы какого-либо химического элемента в составе разных структурных фрагментов, помогает исследовать биохимические процессы в растворах, предоставляя исчерпывающую информацию об изменениях конфигурации биологически активных молекул. Однако и этот метод ограничен – для его успешного применения нужно получить достаточно концентрированный раствор препарата, поэтому ЯМР можно применять лишь для исследования хорошо растворимых небольших по размеру белков, причём тех, которые растворимы во внутри- или внеклеточной жидкостях, а вот для изучения беков, например, связанных с клеточными мембранами, ЯМР бесполезен.

Изучение больших белков, белков-рецепторов, связанных с клеточной мембраной или межмолекулярных ассоциатов, образованных сразу несколькими биологическим активными молекулами, значительно облегчается (а в ряде случаев становится исключительно возможным) при применении криоэлектронной микроскопии.

Преимуществом криоэлектронной микроскопии является то, что для изучения биологической молекулы этим методом нет необходимости готовить её кристаллический образец, а значит, для анализа требуется очень небольшое количество вещества, метод позволяет анализировать частицы, масса которых находится в диапазоне от десятков килодальтон до нескольких мегадальтон. Разновидность метода – криоэлектронная томография – может изучать и более крупные объекты – от комплекса биологически активных молекул до клеточного органоида и даже клетки. Криоэлектронная микроскопия позволяет изучать структуры не только в статичном состоянии – ионный фон, концентрацию низкомолекулярных веществ и рН охлаждаемого для анализа раствора можно систематически менять, что позволяет определять структуру биомолекул и более сложных биологических объектов в окружении, свойства которого максимально близки их естественному окружению в клетке, метод криоэлектронной микроскопии даже позволяет изучить изменения строения фермента в ходе протекания ферменто-катализируемой реакции (Nature, 2015, 521, 241-245; DOI: 10.1038/nature14365). Результаты таких исследований могут применяться на практике – для детального изучения биохимических процессов, изучения строения патогенных вирусов, создания новых и модификации существующих лекарственных препаратов.

Проанализировав историю криоэлектронной микроскопии и ее роль в изучении биохимических систем, Нобелевский комитет решил, что уже доступным в настоящее время и будущим возможностям метод обязан людям, достойными стать лауреатами в 2017 году: Жаку Дюбоше, разработавшему метод приготовления образцов для криоэлектронной микроскопии, Иоахиму Франку, разработавшему математические методы обработки сигналов от ансамблей частиц в растворах и Ричарду Хендерсону, впервые продемонстрировавшему возможность применения криоэлектронной микроскопии для определения структур биомолекул с высоким разрешением.