Чтобы преодолеть главное препятствие при подсчете клеток мозга – гетерогенность их распределения в ткани, я буквально растворила эту гетерогенность в детергенте. Я решила, что если мне удастся растворить в тканях только клеточные мембраны, но оставить в неприкосновенности ядерные мембраны, то я смогу превратить мозг в суп со свободно плавающими в нем клеточными ядрами, которые можно легко посчитать, набрав для этого всего несколько аликвот (небольших объемов) взвеси, которую можно гомогенизировать простым встряхиванием. Так как каждая клетка в головном мозге располагает одним и только одним ядром, то если мне удастся узнать, сколько в мозге клеточных ядер, одновременно я узнаю, сколько в нем клеток. Если бы только у меня была лаборатория…

Роберто Лент, заведующий отделом анатомии и один из руководителей, взявших меня на работу, определенно располагал лабораторией – и, по иронии судьбы, он в это время заканчивал работу над учебником, называвшимся по-английски «Сто миллиардов нейронов». Когда я спросила его, откуда он взял это число, Роберто, как я и ожидала, не смог ответить. «Как бы вы отреагировали, если бы я сказала вам, что знаю, как правильно посчитать клетки?» Роберто отреагировал великолепно. Он не только выслушал мою странную идею, но и дал мне место в своей лаборатории, разрешив пользоваться оборудованием и расходными материалами, несмотря даже на то, что, если моя идея оказалась бы верной, ему пришлось бы менять название руководства (что он позже и сделал), и это получилось у него очень легко. Правда, первое издание уже с успехом разошлось в Бразилии к тому времени, когда был получен результат, но в следующих изданиях к заглавию был просто добавлен вопросительный знак: «Сто миллиардов нейронов?».

На полке в лаборатории валялся забытый кем-то кухонный блендер, а человеческие мозги можно было без труда взять в отделении патологической анатомии в соседнем университетском корпусе. Конечно, я планировала начать с растворения мозгов мышей и крыс, что на первых порах исключало использование блендера; тем не менее каждый раз, входя в лабораторию, я бросала взгляд на блендер и спрашивала себя: «Неужели в один прекрасный день я действительно брошу человеческий мозг в блендер и разотру в мелкий порошок то, что составляло самую сущность человека?» Картина грубого, быстрого и полного уничтожения человеческого мозга не давала мне покоя. Но я все-таки убедила себя, что в конечном счете растворение мозга не так уж сильно отличается от его разрезания на десятки тысяч мелких кусочков, что рутинно делают все анатомы для того, чтобы готовить тонкие срезы мозга для микроскопических исследований. Разница заключалась в том, что это будет не разрезание на мелкие кусочки, а растворение с разделением ткани мозга на еще более мелкие части, на клеточные ядра. Кроме того, по протоколу исследования мне не надо было бросать в блендер большие куски мозга. Скорее, это было похоже на приготовление льда: мозг предстояло рассечь на тонкие пластинки, пластинки на мелкие кубики, а уже кубики растереть в мелкую кашицу.

Вначале мне все же пришлось использовать маленький блендер. Выделение клеточных ядер – это стандартная биохимическая процедура, и я воспользовалась протоколом, который предусматривал глубокое замораживание крысиных мозгов в жидком азоте, для того, чтобы расщепить клеточные мембраны, а затем твердые куски ткани я помещала в ручной блендер. Результат было легко предвидеть: кусочки замороженного крысиного мозга разлетались по всей лаборатории. Превращение же мозга в суп и подсчет всех клеток будут возможны только в том случае, если мне удастся не потерять ни единого ядра. Потери кусочков замороженного мозга, пусть даже они прилипали к крышке блендера, были абсолютно неприемлемы.

Измельчение слегка зафиксированной ткани в ручном стеклянном гомогенизаторе (рис. 2.1) было намного более перспективным. Фиксация в формальдегиде сшивает молекулы белков в тканях, делает их жесткими и прочными. Поскольку ядерная мембрана содержит много белка, она очень хорошо фиксируется формальдегидом и приобретает устойчивость к мощным физическим воздействиям. Первые попытки со свежими, незафиксированными тканями показали мне, что представляют собой разрушенные ядра: они превращались в хлопья свободной ДНК, которая под микроскопом выглядит окрашенной в синий цвет, так как для окраски ядер я применяла краситель DAPI. Препараты из фиксированных в течение всего нескольких часов тканей сохраняли большую долю интактных ядер, но все же многие из них разрушались.

Я нашла решение после того, как начала фиксировать ткани в течение двух недель. Эта идея спасла всю работу: если даже короткая фиксация сохраняла какое-то количество ядер целыми, предохраняя их от разрушения в гомогенизаторе, то тщательная, длительная фиксация делала ткани плотными, как камень, и можно было надеяться, что все до единого ядра оставались целыми в процессе обработки, а это и было целью всего предприятия. Наконец все сработало: когда в каждом опыте я стала получать приблизительно одинаковое число ядер, я поняла, что у меня получился новый, весьма эффективный метод подсчета клеток.

После некоторого обдумывания таких деталей, как сбор ядер и перенос в градуированные пробирки без ощутимых потерь, у меня в руках был стабильный протокол опытов. Он состоял из рассечения твердого, фиксированного мозга на более мелкие, анатомически и функционально значимые области, например на кору целиком, мозжечок, обонятельные луковицы и «остальное» (пока). После взвешивания каждая часть рассекалась на тонкие срезы, затем на мелкие кубики, что облегчало процесс растирания: оно производилось в среде детергента Тритон-Х100 между стеклянными стенками гомогенизатора, что позволяло разрушать клеточные мембраны, но сохранять мембраны ядерные. Двадцать минут вращательно поступательных движений поршнем в цилиндре – и я получала мутную, но без хлопьев жидкость, содержащую взвесь ядер. Мозг был окончательно превращен в суп. Следующий шаг заключался в тщательном сборе ядер – не должно было пропасть ни одно ядро, подлежащее учету. Для этого я несколько раз промывала поршень в цилиндре, потом отсасывала пипеткой ядерный осадок на дне цилиндра, затем снова промывала поршень, снова отсасывала жидкость и так несколько раз, до тех пор пока не получала определенный объем, содержащий все ядра. К этой жидкости я добавляла краситель для окрашивания ДНК, а затем физиологический раствор до объема, который можно было легко определить в градуированном цилиндре. Окрашивание остатка последней промывной жидкости после окрашивания DAPI позволяло убедиться в том, что в гомогенизаторе не осталось больше ядер. Все ядра всех клеток ткани – окрашенные и собранные – находились теперь в известном объеме, готовые к подсчету. Теперь оставалось только встряхнуть суспензию, чтобы равномерно распределить ядра по объему, а потом выбрать несколько аликвот для подсчета и экстраполировать результат на весь объем.

Подсчет свободных клеточных ядер методом флуоресцентной микроскопии не требует специальной подготовки: ядра – это округлые объекты, превосходящие размерами бактерии и митохондрии. Пользуясь гемоцитометром, представляющим собой закрываемую покровным стеклом камеру, имеющую объем 4 нл (4 миллионных доли миллилитра), на дне которой вырезано 25 квадратных углублений, я могла легко посчитать, сколько ядер находилось в 100 нл взвеси, и по пропорции вычислить, сколько ядер содержится во всем известном объеме. Для подсчета ядер под микроскопом в четырех аликвотах у меня уходило 10 минут. Учитывая, что я делала суспензию гомогенной легким встряхиванием перед отбором аликвот, коэффициент вариации составлял меньше 0,10, то есть стандартное отклонение четырех подсчетов составляло не более 10 % от среднего числа клеток в каждой из четырех проб. При таком небольшом отклонении оценка общего числа клеток была так же надежна, как и подсчет клеток стереологическим методом.

Имея на руках число клеток, я воспользовалась тем преимуществом, что существуют антитела, которые специфически связываются с белком, который экспрессируется исключительно в клеточных ядрах нейронов и только в них. Этот белок называют нейрональным ядерным белком (neuronal nuclear protein – NeuN). Он был открыт в 1992 году, когда его функция была еще неизвестна. У NeuN есть одно важное свойство, которое позволило мне надежно считать экспрессию NeuN маркером всех нейронов, и только нейронов, – присутствие NeuN можно выявить связыванием его специфическими антителами, окрашенными красным красителем и добавленными в суспензию. Это потребовало реакции небольшого количества суспензии с меченными красным красителем анти-NeuN-антителами, и спустя несколько часов я уже могла снова поместить ядра под микроскоп для того, чтобы определить, какой процент всех ядер (окрашенных ранее в синий цвет) принадлежал нейронам (которые теперь были окрашены в красный цвет). Подсчета 500 ядер (что заняло ровно пятнадцать минут) хватило для определения процента нейронов с точностью до 0,2 %. Приложив это процентное отношение нейронов к общему числу клеток в выбранных структурах, я получила общее число нейронов в них. Вычтя это число из общего количества клеток, я получила число всех остальных клеток в ткани (вероятно, это было число глиальных клеток). Сложив результаты, полученные для каждой структуры – а я начала с простого разделения целого мозга на мозговую кору, мозжечок и все остальное, – я впервые в истории получила прямую оценку общего числа нейронов и других клеток в целом мозге крысы. Вся процедура была выполнена меньше чем за один рабочий день.

Я была страшно взволнована. Я теперь знала то, чего в этот момент не знал ни один человек в мире: сколько клеток содержится в целом мозге крысы.

Возник, правда, еще один вопрос: насколько достоверны эти данные, а достоверность в нейроанатомии означает сравнение полученных данных с данными, полученными стереологическим методом. Сравнение было невозможно для тех областей мозга, которые недоступны стереологическому исследованию; в конце концов главной целью создания нового метода и была возможность исследовать те области, где была неприменима стереология. К счастью для нас, в литературе нашлось несколько работ со стереологическими оценками количества нейронов в коре и мозжечке крысиного мозга. Наши результаты были сопоставимы с данными этих работ.

В 2004 году Карл Херруп, работавший в то время в Кливлендском университете, приехал на организованный Роберто и мною в Кашамбу (Бразилия) симпозиум, посвященный важности проблемы определения числа клеток в головном мозге. Карл давно интересовался подсчетом клеток в мозжечке – это его любимый отдел мозга, – но оставил эту идею в связи с отсутствием адекватного метода (мозжечок является плохим объектом стереологического метода из-за высокой плотности расположения крошечных нейронов в зернистом слое, которые расположены настолько тесно, что сливаются при рассматривании их под микроскопом). Карл был научным руководителем одной моей близкой подруги, и благодаря этому я когда-то смогла получить место в его лаборатории и всегда считала его моим неофициальным наставником. Когда в Кашамбу я объяснила Карлу суть моего метода подсчета мозговых клеток, он улыбнулся: «Я думал о чем-то подобном несколько лет назад. Я хотел использовать цитометрию в потоке для подсчета клеток, выделенных из ткани. Но серьезно этой проблемой я так и не занялся. Вы меня опередили, и я рад, что у вас это получилось!» Узнав, что статья о работе уже готова, но не опубликована, Карл сразу же вызвался стать ее редактором в Journal of Neuroscience. А в 2005 году после тщательного обсуждения статьи коллегами Роберто и я получили оттиск статьи, напечатанной в одном из самых авторитетных журналов в этой области биологии.

Несмотря на то что превращение мозга в суп для подсчета общего числа клеток в мозге давало результаты, сравнимые с таковыми, полученными стереологическим методом (там, где такие результаты были), а полученные данные становились все более и более убедительными по мере того, как мы анализировали мозг других биологических видов, наш метод столкнулся с довольно сильным сопротивлением со стороны некоторых специалистов, особенно тех, кто видел, как их любимые теории рушатся перед лицом данных об ином количестве клеток в мозге. Рецензенты и критики хотели видеть одно и то же доказательство – параллельное сравнение нового метода с проверенным стереологическим методом. Я не имела опыта в стереологии, поэтому самостоятельно не смогла бы осуществить такое сравнение еще в течение многих лет. Однако в конце концов, что было к лучшему, не я доказала нашу правоту. Это было сделано независимо от нас в 2014 году Кристофером фон Бартхельдом из университета Рено, а также Дэниелом Миллером и моим будущим сотрудником Джоном Каасом из университета Вандербильта в Нэшвилле. С тех пор как мы с Джоном начали сотрудничать в 2006 году, в его лаборатории была разработана автоматизированная модификация нашего метода подсчета клеток с применением флоуцитометра. Джон и Крис показали, что, по меньшей мере, наш новый метод превращения головного мозга в суп не только так же точен, как стереологический, но он требует меньше времени, более надежен и прост в выполнении. Кроме того, как и было задумано, наш метод позволял получать надежные результаты для сложных гетерогенных структур, как, например, головной мозг, которые невозможно анализировать стереологическими методами.

Новый метод между тем не был назван «методом мозгового супа». Нам было сказано, что этот метод похож на жидкостную версию оптического фракционирования – стереологического метода, в ходе выполнения которого ткани рассекают на срезы, срезы на блоки, а блоки помещают в оптические пробы, и только после этого начинается подсчет клеток. Мы с Роберто тоже поняли, что наш метод должен быть назван «фракционированием». Поскольку мы пошли дальше подсчета клеток в кубиках ткани и расщепили кубики на самые мелкие составные части – ядра, я предложила название «окончательное фракционирование», но Роберто мудро отклонил его. Дело в том, что мы превратили гетерогенную ткань в гомогенную, то есть «изотропную», суспензию ядер, и он предложил другое название – «изотропное фракционирование». Это название осталось за неимением лучшей альтернативы. Не кто иной, как Карл Херруп, заметил мне, что название получилось очень неуклюжим, и я с ним согласилась. Там, где это возможно (а это случается нечасто, так как редакторы научных журналов не любят нарушений формальностей), я предпочитаю называть метод тем, чем он является на самом деле, – методом «мозгового супа».