Естественно, и Рогаев с соавторами анализировали митохондриальную ДНК: она сохраняется лучше ядерной, и по ней существуют обширные базы данных, показывающие популяционную изменчивость. В первую очередь нужно было секвенировать гипервариабельные участки – HVR1 и HVR2, в которых сосредоточено особенно много индивидуальных различий, – и убедиться, что с полученной ДНК вообще можно работать. Последовательности ДНК из образцов 146 и 147 буква в букву совпали с образцами 7, 3, 5, 6, а также с ранее опубликованной мтДНК принца Филиппа.

Успех вдохновил исследователей на смелую идею: почему бы не реконструировать полную последовательность митохондриальной ДНК царицы и ее детей? И это было сделано. Разработали специальные праймеры для амплификации отдельных перекрывающихся участков мтДНК. Существующие методики не годились, так как не были рассчитаны на амплификацию ДНК, состоящей из обрывков. Пришлось использовать много хитрых приемов, уменьшающих вероятность потери какого-либо фрагмента. В итоге для образцов 7, 146 и 147 (царица, Мария и Алексей) удалось получить полную последовательность митохондриальной ДНК длиной 16 571 нуклеотид.

Митохондриальная ДНК Александры Федоровны и ее детей – это, как мы уже говорили, мтДНК королевы Виктории, “бабушки королей”. И чтобы окончательно убедиться в достоверности результата, следовало сравнить полученную последовательность с мтДНК ныне живущих потомков Виктории по женской линии – детей ее дочек, внучек и правнучек.

Снова обратились с просьбой к принцу Филиппу, но он ответил, что уже давал свою кровь ученым в 1990-х, результаты исследования опубликованы и желающие могут с ними ознакомиться. Однако в работе, которой гарантирована пристрастная критика, не хотелось полагаться на литературные данные. Исследователи нашли других прямых потомков, не столь знаменитых, как британский принц. Удалось разыскать представителей двух независимых линий: дочку и внучку сестры принца Филиппа и правнучку с праправнучкой принцессы Беатрисы, родной тети Александры Федоровны. Это могло помочь идентифицировать случайную мутацию, если бы она имела место. Но анализ показал полное совпадение. В могилах под Екатеринбургом действительно лежали внучка, правнучки и правнук английской королевы. А последовательность, которая получила название Queen Victoria mitotype, авторы работы поместили в банк данных. Интересно будет проследить ее дальнейшую судьбу в популяциях.

Митохондриальную ДНК из образца 4 (Николай II) также реконструировали полностью и сравнили с мтДНК родственников по материнской линии его сестер. Она была на два нуклеотида короче, чем у императрицы и детей, а единственное несовпадение у Николая с ныне живущей его правнучатой племянницей (Ксенией Шереметевой-Сфири, которая участвовала и в предыдущем исследовании) было за счет все той же гетероплазмии в гипервариабельной области, в позиции 16 169.

Гетероплазмию у членов дома Романовых, как упоминалось выше, обнаружили еще Павел Иванов с Питером Гиллом. У Николая в этом положении был либо тимин, либо цитозин – то есть митохондрии одного человека не были генетически идентичными, геномы разных митохондрий отличались на одну букву, – и такая же картина была у его брата, великого князя Георгия, а вот у Ксении, правнучки Ксении Александровны, там было четкое Т. Но группа Евгения Рогаева получила дополнительную интересную информацию: у сына другой сестры Николая, Ольги – Тихона Куликовского-Романова, проживавшего в Канаде, – в этой позиции оказался цитозин.

С Тихоном Куликовским-Романовым была отдельная драматическая история. В свое время он отказался предоставить свою кровь для исследования Иванову и Гиллу и в резких выражениях заявил о своем недоверии к ним. Однако образец крови завещал своей жене, а Ольга Куликовская была более милостива к Евгению Рогаеву, чем к другим экспертам: ему было позволено исследовать ДНК племянника императора. Результат был положительным: все совпало, кроме того самого цитозина.

Итак: люди, чьи обугленные кости найдены в “екатеринбургском могильнике”, – родственники королевы Виктории, императрицы Марии Федоровны, родственники ныне живущих представителей королевских домов. Довольно ли вам этого? Нет, отвечают скептики. У них возникает вопрос: а вправду ли митотипы королевы Виктории и принцессы Дагмары уникальны и присущи только их кровным родственникам? Может быть, таких митотипов в уральской популяции полно? Дело осложнялось тем, что американские и российские базы данных не очень хорошо подходили для определения частот встречаемости западноевропейских мтДНК.

Чтобы отвести это возражение, авторы работы создали собственную базу данных, в которую включили этнические группы, проживающие на территории России, а также европейскую популяцию – немцев, англичан и т. д. Совпадений не было обнаружено.

Интересно, что даже в более обширной мировой базе (71 000 человек) нашелся всего один индивид с полным совпадением по гипервариабельному участку. Эта женщина, проживающая в Канаде, была несколько встревожена, когда узнала о своем возможном родстве с королевскими домами Европы. (И в самом деле, среди ее предков были немцы.) Однако когда у этой женщины взяли образец ДНК, оказалось, что ни второй гипервариабельный участок, ни полная последовательность мтДНК у нее не имеют ничего общего с митотипом королевы Виктории. Версию “случайного” появления именно такого митотипа на Урале можно с чистой совестью отбросить.

Конечно, была исследована не только мтДНК, но и содержащаяся в ядрах клеток – в половых и неполовых хромосомах. Мы еще не рассказывали, как палеогенетики узнают, мужчине или женщине принадлежит фрагмент кости, а именно эту задачу надо было решить для образцов 146 и 147. Ведь X- и Y-хромосомы разрушены, увидеть под микроскопом их не удастся, приходится искать гены, характерные для той и другой.

Обычно для этого используют гены амелогенина – белка, который экспрессируется в зубной эмали при формировании нового зуба. Замечателен он тем, что его гены имеются и в X-, и в Y-хромосоме, но отличаются по размерам: “мужской” вариант длиннее. Если поставить амплификацию этого гена, у женщины (хромосомы XX) на электрофорезе будет одна полоска, а у мужчины (XY) – две.

Однако при малом количестве материала фрагмент Y-хромосомы с амелогениновым геном может потеряться, и тогда мы ошибочно примем мужской образец за женский. Поэтому исследователи подобрали в дополнение к коммерческим собственные маркеры для определения пола (некоторые из них были запатентованы). Обе системы идентификации дали один и тот же результат: образец 146 принадлежал лицу мужского пола, а 147 – женского, что соответствовало исходному предположению о царевиче Алексее и великой княжне Марии. Дополнительно теми же методами был подтвержден пол останков из первого захоронения.

Заметим, что анализ половых хромосом и аутосом в случае древней ДНК становится непростой задачей. Для анализа STR-маркеров, как мы помним, не требуется секвенирование, определяется только длина участков ДНК между известными последовательностями, а длина у разных людей варьирует в зависимости от числа этих самых повторов. Но, когда ДНК сильно деградирована, невозможно следовать готовой методике даже в простейших вопросах: например, сколько ДНК брать для анализа. Приемы, увеличивающие чувствительность, приходилось изобретать на ходу.

И это исследование прошло успешно: все данные по STR в аутосомах соответствовали семейному распределению, то есть каждый конкретный вариант, найденный у любого из детей, имелся также либо у матери, либо у отца.

Группа Рогаева также исследовала ДНК родственников Николая по мужской линии – по STR-маркерам в Y-хромосоме. (Значительную часть этой работы проделала Анастасия Григоренко.) Для Николая II такой анализ раньше не делался, а ДНК наследника вообще была получена впервые. С образцом 146 было особенно сложно, ДНК в нем оказалась разрушена сильнее всего, но удалось получить убедительный результат и для него. И по этой линии родство подтвердилось, STR-маркеры Y-хромосомы из останков отца и сына полностью совпали с такими же маркерами ныне живущих родственников царя по мужской линии. В то же время Y-хромосомы посторонних людей (например, самих исследователей) давали совершенно иную картину. И опять-таки, как и в случае мтДНК, поиск в базах данных не выявил ни одного совпадения по всем 17 исследованным маркерам.

Однако идентификацию образца 4 хотелось провести с максимальной достоверностью. И здесь ученым повезло. Как уже говорилось, в 1891 г., во время кругосветного путешествия наследника престола, в Японии на него было совершено покушение: Николай Александрович получил рубящий удар саблей по черепу. С тех пор, более 100 лет, в Эрмитаже хранилась рубашка Николая, запятнанная кровью, и В. Н. Соловьев сумел организовать ее исследование. Сотрудники Эрмитажа позволили Евгению Рогаеву осмотреть рубашку, но уносить ее в лабораторию не разрешили: образцы пришлось брать на месте, под присмотром.

Шансы на успех казались проблематичными. Рубашка хранилась как музейный экспонат, а не как “биоматериал”, бывала на выставках, лежала на свету, возможно, подвергалась действию реагентов, которые способствуют сохранению ткани, но разрушают ДНК… Тем не менее попытка была предпринята. Стерильным ватным тампончиком взяли мазки из разных мест на рубашке, причем из каждой точки по три мазка: если первый окажется загрязненным, то, возможно, последние будут чище. Экстракцию ДНК опять проводили в двух научных центрах – в ИОГене и Массачусетсе. Естественно, вся работа велась с массой предосторожностей и многочисленными контролями.

Первый же анализ коротких ампликонов мтДНК показал очень четкую картинку. Качество было значительно выше, чем у ДНК из костных фрагментов. Совпали и все редкие полиморфизмы, и гетероплазмия. Имело смысл попытаться исследовать и ядерную ДНК. Такая попытка была предпринята, и с Y-хромосомой все получилось так же удачно. Кровь на рубахе и скелет № 4 оказались генетически идентичными.