Профессор Анита Козирски – представитель исследовательской программы по изучению кишечной микробиоты детей в Канаде. Она описывает передовые результаты исследования микробиоты детей, рожденных вагинально, и детей, рожденных в результате кесарева сечения.

Ниже приводится краткое содержание ее интервью создателям фильма «Микророждение» Тони Харман и Алексу Уэйкфорду в провинции Альберта, Канада, в августе 2013 года.

«Исследовательская программа Synbiota (Synergy in Microbiota Research Programme) основывается на данных, полученных в результате исследования CHILD (канадское долгосрочное исследование развития здоровых детей) в четырех провинциях Канады: Ванкувере, Эдмонтоне, Виннипеге и Торонто. Женщины начинали принимать участие в исследовании во время беременности. Мы собирали образцы первого стула новорожденных – мекония. Это были здоровые дети, родившиеся в срок (мы исключали из исследования преждевременно рожденных), у нас есть информация о состоянии их здоровья, а также о состоянии здоровья их матерей во время беременности и послеродового периода. И мы соотносим эти данные с другими образцами стула: меконий сразу после рождения, стул в три месяца жизни и в возрасте года.

Наша гипотеза состоит в том, что микробиота разных детей отличается по видовому составу, и это определяет состояние здоровья иммунной системы ребенка. Бывают ситуации, когда иммунная система начинает воспринимать частицы, не представляющие опасность для организма, как патогенные. То есть, даже в случае, если визуально не удается увидеть изменение в системе в виде определенного симптома, это не означает, что изменение не произошло. И сегодня, изучая кишечную микробиоту новорожденных с помощью новейших технологий и методов, наблюдая, какие виды микроорганизмов присутствуют в каждый временной промежуток на первом году жизни, мы можем отследить эти изменения».

«Мы применяли так называемое секвенирование нового поколения. Это современная технология, позволяющая определить, какие именно бактерии присутствуют в образцах стула. До внедрения этого нового метода было необходимо делать посев образца стула на питательной среде и наблюдать, какие бактерии вырастут. Новая технология позволяет первым делом выделить ДНК из образца стула, затем мы делаем копии ДНК (так как мы не хотим использовать все доступные образцы ДНК), затем с помощью этих копий мы определяем последовательность ДНК, и на основании этой последовательности определяем тип бактерий.

Все бактерии имеют сходную последовательность ДНК между определенными участками. В то же время они имеют участки, отличающиеся от вида к виду, их мы называем гипервариабельными. И именно эти участки позволяют нам определить, какой именно микроорганизм перед нами.

Целью нашего проекта (и многих других сходных) является выделение этих отличных участков ДНК, чтобы не было необходимости каждый раз тратить время, деньги и энергию на секвенирование сходных участков. Если сразу выделить специфический участок и сравнить его с базой данных, то можно быстро определить тип бактерии. Таким образом, становится возможным обнаружить в образце стула присутствие Lactobacillus или Bifidobacteria (виды бактерий, присутствующие в йогурте) или, напротив, нежелательной гостьи Clostridium difficile.

В результате нашей работы база данных будет содержать образцы, собранные у 3300 детей. Недавно мы опубликовали результаты пилотного исследования двадцати четырех детей, что, конечно, пока очень маленькая цифра. Небольшое число связано с тем, что у нас заняло много времени привлечение к участию в исследовании CHILD беременных женщин и затем сбор образцов стула детей. Также довольно долгим оказался процесс выделения ДНК из образцов и их последующее секвенирование. Иногда процесс занимал неделю, так как происходила регистрация миллиардов последовательностей ДНК. Также следует учитывать, что технология, которую мы используем, еще только развивается, и когда я говорю о секвенировании нового поколения, я подразумеваю, что этот процесс постоянно совершенствуется. И есть разные платформы, на которых происходит работа.

Я эпидемиолог. Я лично не выполняю описанную выше часть работы, а сотрудничаю с Джеймсом Скоттом, микробиологом из университета Торонто. Выделением ДНК занимается его лаборатория. У меня есть коллега Дэвид Гуттман, он отвечает за секвенирование образцов.

Благодаря его работе в нашем распоряжении оказываются миллиарды последовательностей ДНК. Теперь наша задача – сравнить их с имеющимися в базе образцами.

Этот этап работы выполняется в электронном виде с помощью недавно разработанных компьютерных программ, которые выстраивают последовательность в соответствии со стандартом. Также в этом процессе участвует специалист по биоинформатике, в его задачу входит контроль над правильным выстраиванием последовательностей. В результате для каждого младенца формируется таблица. Каждая колонка – это отдельный вид бактерии.

С помощью современного поколения технологий секвенирования нам удалось выявить все присутствующие в образце виды микроорганизмов. Ранее исследователи лишь предполагали, какие бактерии могут присутствовать, и искали именно их. Сегодня мы можем идентифицировать бактерии, которые раньше оставались для нас скрытыми. Именно поэтому собирается такое большое число данных. Впрочем, количество информации в образце стула новорожденного меньше, чем у взрослого.

В результате анализа данных мы формируем для каждого ребенка так называемый операционный таксономический блок, или ОТБ (OTU, Operational Taxonomic Unit). В него, в том числе, попадают микробы, о существовании которых мы не догадывались раньше. В соответствии с микроорганизмами, входящими в состав ОТБ каждого отдельного ребенка, мы классифицируем детей и присваиваем им определенный статус. Затем мы анализируем эти данные в их связи с такими критериями, как антибиотики, принимаемые ребенком, тип вскармливания и способ рождения.

В нашем исследовании у нас есть возможность сравнить видовой состав кишечной микробиоты младенцев с микробными профилями пыли окружающей среды, чтобы выяснить, является ли пыль важным источником микробов для детей. Представьте себе малыша, который ползает по полу и контактирует с пылью. Этот аспект вызывает множество вопросов относительно окружающей среды, в которую попадает родившийся ребенок.

В нашем пилотном исследовании участвовали двадцать четыре новорожденных, и этого количества недостаточно, чтобы исследовать все основные источники микробов. Мы планируем более крупное исследование. Нам хотелось бы суметь отследить изменения в микробиоте детей, связанные с приемом антибиотиков в три месяца жизни, типом вскармливания и способом рождения, и сравнить эффект присутствия этих трех факторов. Также нам хотелось бы выявить индивидуальный, независимый от прочих эффект каждого из факторов».

«Объем нашего пилотного исследования, к сожалению, не позволяет выделить эффекты от приема антибиотиков. Но нам удалось сделать определенные выводы, анализируя отличия в зависимости от того, каким образом ребенок появился на свет, и находился ли он исключительно на грудном вскармливании в возрасте трех первых месяцев жизни.

Из двадцати четырех детей, которых мы выбрали среди участников исследования для изучения их микробиоты в возрасте трех месяцев жизни, только шестеро были рождены в результате кесарева сечения. Среди этих детей реже встречались бактерии, относящиеся к группе бактероидов. Такие же отличия встречались у детей, находившихся или не находившихся на грудном вскармливании. То есть конкретный вид бактерий – бактероиды – в меньшем количестве присутствует у детей после кесарева сечения. Такие же результаты были получены и другими исследователями.

Хотя наша выборка была небольшой, мы получили сходные с другими исследованиями результаты. Говоря о других исследованиях, я подразумеваю те, что были проведены в Европе (одно – в Нидерландах, другое – в Швеции), они изучали кишечную микробиоту новорожденных с помощью новых технологий секвенирования.

Остановимся подробнее на грудном вскармливании. Мне кажется, многие согласятся с тем, что грудное молоко в состоянии изменить видовой состав кишечной микробиоты младенцев. Это связано с тем, что некоторые из бактерий попадают в кишечник непосредственно из молока матери. Это довольно интересный феномен. Нам удалось обнаружить, и эти данные соответствуют результатам других исследований, что у детей, находившихся на исключительно грудном вскармливании, видовое разнообразие бактерий в кишечнике, то есть количество разных видов бактерий, было уже, чем у детей, полностью вскормленных искусственно. Дети на смешанном вскармливании (которые частично питались грудным молоком, а частично его заменителями) обнаруживали средние показатели видового разнообразия кишечной микробиоты.

Это интересный вывод, так как некоторые другие публикации говорят о малом разнообразии видов как о факторе риска для развития, например, аллергических заболеваний. Но как может грудное молоко, питание которым связано с меньшим видовым разнообразием микрофлоры, оказаться фактором риска развития аллергии, если оно по определению не может им быть?

В связи с этим мы очень заинтересованы в том, чтобы точнее установить: приводит ли меньшее видовое разнообразие бактерий в кишечнике детей, находящихся на грудном вскармливании, к большей вероятности развития аллергических заболеваний. В то же время мы установили некоторые другие интересные факты, связанные с грудным молоком.

Только некоторые виды кишечных микробов в состоянии расщепить сахара грудного молока и любят питаться ими – в отличие от смеси, чьи сахара могут расщеплять большее количество микроорганизмов, обитающих в кишечнике. Таким образом, у детей, получающих смесь, в кишечнике размножается большее количество видов бактерий, чем у детей на грудном вскармливании, ведь сахара грудного молока могут стать пищей меньшего количества видов бактерий. На наш взгляд, это положение вещей не имеет ничего общего с повышенным риском развития заболеваний, в том числе аллергических, однако для более точных результатов необходима большая выборка участников исследования».

«Среди участников нашего пилотного исследования дети, рожденные при помощи кесарева сечения, имели в кишечнике меньше бактерий вида бактероиды по сравнению с детьми, рожденными через естественные родовые пути. В возрасте трех и четырех месяцев жизни у этих детей количество бактероидов также было ниже, чем у детей, родившихся вагинально. Вопрос заключается в том, является ли эта тенденция устойчивой? Сегодня у нас есть возможность исследовать этих детей в возрасте года. Таким образом, на сегодняшний день наша база данных пополнена информацией о двухстах детях, и мы движемся к полному исследованию трех тысяч трехсот детей.

Рассматривая наших двухсот детей, мы видим, что их «отпечатки» специфичны в зависимости от возраста. Мы видим сходную картину в возрасте года. В этом возрасте различия межу видовым составом микробиоты детей не настолько разительны. В возрасте трех-четырех месяцев у детей, рожденных в результате кесарева сечения, было меньшее содержание вида бактероидов. В возрасте одного года этот вид бактерий был также представлен меньшим количеством, но разница по сравнению с естественно рожденными детьми была уже не настолько сильной.

Таким образом, мы предполагаем, что бактериальные «отпечатки» специфичны для каждого возраста: сразу после рождения, в возрасте недели, трех месяцев и года жизни. За некоторое время до родов и непосредственно во время родов могут происходить определенные воздействия, оказывающие влияние на то, каким будет бактериальный «след» ребенка. Речь идет о таких факторах, как прием будущей матерью антибиотиков, оперативное родоразрешение и отсроченное начало грудного вскармливания.

В некоторых случаях имеют место все три упомянутых фактора, и это оказывает большое влияние как на закладку, так и на дальнейшую колонизацию кишечника ребенка. Развитие кишечной микробиоты происходит последовательно. Есть бактерии-основатели, которые колонизируют кишечник первыми и создают условия для заселения следующих видов микроорганизмов. Эти следующие виды и есть те бактерии, которые остаются с человеком на большую часть жизни, бактероиды – один из видов таких последующих бактерий.

Насколько нам известно (большинство современных данных получено от применения старых микробиологических техник, но мы получаем подтверждение этим данным и с помощью новой методологии), ребенок после вагинальных родов начинает жизнь с низким уровнем бактероидов в кишечнике, и в течение первого года жизни их содержание увеличивается. В случае кесарева сечения младенец начинает жизнь с еще более низким уровнем, который со временем также повышается.

Возникает вопрос: это связано с тем, что закладка микробиома была разная? И те микробы, которые ребенок получает от матери, может быть, они попадают в кишечник ребенка откуда-то еще? Возможно, первоначальный сценарий другой, и это создает отличные условия среды для последующего заселения другими видами бактерий? Может быть, вид бактероидов не настолько восприимчив к этим условиям (и поэтому содержание этого вида бактерий примерно одинаково в год жизни). Я всего лишь предполагаю. Но именно поэтому, когда кто-то спрашивает о бактериальных «отпечатках», нельзя просто ответить, что важнее – «отпечатки» в три месяца жизни или в год. На наш взгляд – мой и моих коллег – важна последовательность колонизации кишечника в течение первого года жизни.

Конечно, всем хотелось бы знать, играют ли роль эти изменения в бактериальных «отпечатках» в формировании здоровья в будущем. Ответ на этот вопрос – одна из задач, которую мы ставим перед собой в рамках нашего исследования, в частности, речь идет об аллергических заболеваниях и бронхиальной астме, а также о лишнем весе. Пока я не готова формулировать выводы о взаимосвязи, мы еще не проанализировали все данные. На сегодняшний день наши усилия в основном были сосредоточены на поиске эффективных методов, работающих на новых платформах для секвенирования, мы смотрели, являются ли получаемые последовательности наилучшими с точки зрения идентификации бактерий».

«В нашем пилотном исследовании (в котором мы наблюдали за здоровьем двадцати четырех детей, и этот результат уже подтвержден в рамках более крупного исследования двухсот детей), важно было установление связи между кесаревым сечением и более низким содержанием в кишечнике бактерий вида бактероиды.

В идеале в наших более широкомасштабных исследованиях нам хотелось бы разделить детей, рожденных оперативно (значимо, когда началось оперативное вмешательство: до начала родовой деятельности или после). Воздействия, которым ребенок подвергается во время схваток, могут играть важную роль. Я считаю, ценно было бы сравнить таких детей на предмет различий в видовом составе кишечного микробиома.

Также мы хотели бы рассмотреть этот вопрос в контексте периода беременности. Мы исследуем меконий – первый кал новорожденного. Первоначально считалось, что он стерилен и не содержит бактерий из кишечника, что бактерии появляются в стуле только после рождения. Но данные новейших исследований указывают на то, что и в меконии присутствует некоторое количество определенных видов бактерий. Отличия в видах этих микроорганизмов отсылают нас к периоду беременности и особенностям питания (и образа жизни) будущей матери.

Может быть, определяющим фактором оказывается то, что кесарево сечение было проведено после начала родовой деятельности, по медицинским показаниям. А возможно, ключевую роль сыграли определенные факторы во время беременности.

Поэтому, на мой взгляд, очень важно не объединять все роды, проведенные с помощью кесарева сечения, в одну группу. И воздействия, которым подвергаются дети во время операций, не одинаковы. Даже с таким простым фактором, как применение антибиотиков, не все однозначно. Если речь идет о простом кесаревом сечении, мать обычно получает дозу антибиотиков однократно. Если во время беременности у женщины были осложненные инфекции, она получит дополнительные дозы. Таким образом, в этих случаях речь может идти об оперативных родах, но о разных дозах полученных до родов антибиотиков.

Также бывают случаи, когда ребенок рождается с признаками инфекции. В одной из публикаций высказано предположение, что дети, рождающиеся в результате элективного (по выбору матери) кесарева сечения, чаще появляются на свет с симптомами патологии дыхательной системы, чем другие дети, что может приводить к тому, что неонатологи с целью профилактики инфекций назначают им антибиотики. В операциях кесарева сечения могут иметь место разные факторы воздействия, но часто их сводят в одну категорию, и это видно по публикациям.

Вдумчивый исследователь будет стараться рассматривать кесарево сечение в зависимости от того, когда его произвели (до начала родовой деятельности или после), и всегда иметь в виду возможность контакта новорожденного с материнской микробиотой. Потому что бактериальные «отпечатки» могут различаться в связи с присутствием или отсутствием этого взаимодействия в родах, а также с применением антибиотиков и организацией грудного вскармливания. На мой взгляд, все эти факторы действительно играют ключевую роль».

«Результат нашего пилотного исследования, воспроизведенный также и в более широкомасштабной работе, говорит о том, что у детей, рожденных в результате кесарева сечения, в кишечнике в меньшем объеме представлены бактероиды. Следующий вопрос: играет ли это роль в формировании здоровья ребенка?

На текущий момент научная литература не содержит данных о связи между этим видом бактерий и аллергическими заболеваниями, а также бронхиальной астмой. И именно эта связь находится в сфере наших интересов. Мы ставим следующий вопрос: является ли это маркером, который в комбинации с другими факторами увеличивает риск?

Наша группа исследователей установила, что у детей после кесарева сечения и тех, кто находился преимущественно на искусственном вскармливании, меньше представлены бактероиды (по сравнению с другими детьми). В последующих исследованиях было бы полезно поставить вопрос о связи наличия и количества этого вида бактерий с повышенным риском, например, аллергических заболеваний.

Однако в то время как в экспериментальных работах с животными была доказана роль этого вида бактерий в тренировке иммунной системы, о ее связи с развитием аллергических заболеваний или бронхиальной астмы пока никто не сообщал. В то же время, в связи с данными заболеваниями говорят о другом виде бактерий – клостридиях. Мы в своем исследовании, посвященном сравнению микробиоты в соответствии с методом рождения, различий в содержании этого вида бактерий не обнаружили. Но мы исследовали небольшое число детей. Также мы не принимали в расчет применение антибиотиков, что, на мой взгляд, является важным фактором.

Помимо того, мы не полностью проанализировали данные касательно типа вскармливания: исключительно грудное вскармливание на протяжении определенного периода времени, искусственное вскармливание, какой вид смеси, сроки введения прикорма, вид прикорма. Наше пилотное исследование показывает большее разнообразие видов бактерий в кишечнике у детей на искусственном вскармливании. Также существуют определенные виды бактерий, присутствующие преимущественно у искусственно вскормленных детей. Один из таких видов – это как раз бактероиды. Необходимо измерить и проанализировать все возможные воздействия. И именно это мы планируем сделать в своих будущих исследованиях».