В 1967 году Динер и Реймер, ученые, работавшие в Исследовательском центре Министерства сельского хозяйства США в Белтсвилле (штат Мэриленд), опубликовали статью, озаглавленную: «Веретенообразный вирус картофельного клубня: вирус растения со свойствами свободной нуклеиновой кислоты». Через семьдесят лет после того, как был описан первый вирус, у вирусологов появилось новое поле для исследования. За эти семьдесят лет во многих исследованиях вирусы были в достаточной степени охарактеризованы как важная причина заболеваний у людей, а также у экономически важных животных и растений. Все эти вирусы состоят из нуклеиновых кислот, упакованных в капсид, иногда одетый в липидную оболочку. Вирус веретеновидности картофельных клубней поражает рост стебля и листьев картофеля, а в 1923 году было показано, что это заболевание вызывается фильтрующимся инфекционным агентом – вирусом. Патологические эффекты вируса веретеновидности картофельных клубней часто варьируют, и их трудно выявить, но после того, как был подобран подходящий суррогатный хозяин, начались серьезные исследования вируса веретеновидности картофельных клубней. За пять лет до этого Реймер открыл, что этот вирус может расти на томатах; еще важнее было то, что он вызывал отчетливые и воспроизводимые признаки заболевания. Теперь в распоряжении исследователей было индикаторное растение, которое позволяло количественно оценивать заразительность препаратов вируса. Теперь появилась возможность биохимического выделения и характеристики вируса. В 1967 году вышла одна из статей в серии работ, в которых была выяснена истинная природа инфекционного агента вируса веретеновидности картофельных клубней. Ученые использовали разнообразные физические и биохимические методы для определения природы инфекционных частиц, выделенных из листьев пораженного картофеля. Результаты исследований оказались беспрецедентными; инфицирующая способность для растений томата ассоциировалась с частицами, которые при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы оказались намного менее плотными, чем все другие, исследованные до тех пор вирусы. Более того, инфицирующая способность препаратов оказалась резистентной к воздействию фенола (вещества, используемого для денатурации и экстракции белков из вирусных частиц), а при обработке нуклеазами была устойчива в отношении дезоксирибонуклеазы и поддавалась действию рибонуклеазы только при низкой концентрации солей. Ученые были осторожны в своих выводах: «Независимо от химической природы вируса веретеновидности картофельных клубней, наш опыт демонстрирует, что он является весьма необычным патогеном. Если учесть нуклеиново-кислотные свойства вируса веретеновидности картофельных клубней, легкость, с какой он передается, его удивительная устойчивость и высокоспецифичная инфекционность просто поражают» (Diener, Raymer, 1967). Еще более любопытным оказался тот факт, что высокотоксичные экстракты практически не поглощали свет в ультрафиолетовом спектре. Вирус было невозможно выявить с помощью той самой методики, которую применяют для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот. Более того, экстракты можно было разводить в миллион раз, но они, несмотря на это, продолжали заражать растения томата. Если инфекционным агентом действительно была нуклеиновая кислота, то она присутствовала в экстракте в ничтожно малых концентрациях, но обладала большой силой. Инфицирующей единицей, как было установлено позже, оказалась крошечная, замкнутая в кольцо одноцепочечная нить РНК, которая в физиологических условиях существует в форме компактной, плотно упакованной и свернутой структуры. Вскоре эта структура была визуализирована под электронным микроскопом. При наложении ее на изображение ДНК-содержащего бактериофага T7 она выглядела как крохотное пятнышко на фоне переплетенных нитей генома бактериофага. Этот класс инфекционных агентов, которые посчитали субвирусными, получил наименование вироидов. В 1978 году вирус веретеновидности картофельных клубней стал первым патогеном эукариот, у которого была расшифрована полная последовательность генома. Открытие вироидов стало научным водоразделом, открывшим эру геномики.

К сегодняшнему дню описаны более тридцати видов вироидов, принадлежащих к двум четко различающимся семействам (Flores et al., 2014; Tsagris et al., 2008; Tabler, Tsagris, 2004; Flores et al., 2005; Daros, Elena, Flores, 2006). Эти вироиды инфицируют множество других растений, среди которых экономически важные сельскохозяйственные культуры, такие как цитрусовые, баклажаны, кокос и авокадо, а также такие декоративные растения, как хризантемы и колеусы. Все вироиды имеют геном, состоящий из одноцепочечной РНК длиной 246–401 нуклеотид – это приблизительно в десять раз меньше, чем геном самого мелкого бактериофага. Геном кольцевидный и компактно свернут благодаря наличию водородных связей между нуклеотидами, которые определяют образование комплементарных пар и сложной вторичной структуры. Наиболее примечательным аспектом вироидов является то, что их генетический материал не кодирует белков, но они способны эффективно организовывать свою репликацию и передачу между клетками и даже между разными растениями. По причине своей невероятной простоты они выработали способы использовать исключительно клеточные белки для поддержания своего существования. Вироиды – это убедительная иллюстрация того, что образование фенотипа вовсе не является прерогативой белков. Вироиды напоминают нам о том, что последовательности оснований нуклеиновых кислот сами по себе могут определять функции и фенотип. Первичная нуклеотидная последовательность вироидов «кодирует» все сигналы, необходимые для рекрутирования клеточных функций и их использования для репликации и передачи инфекционных частиц; эта последовательность определяет фенотип, экспрессируемый вироидом. Именно этот фенотип должен быть объектом давления естественного отбора. Несмотря на ту особенность, что вироиды не кодируют белки или капсид, они тем не менее отвечают критериям независимо развивающейся эгоистической генетической информации: в моей книге они считаются по своей сути вирусами.

Формы существования вироидов отнюдь не просты и различны у двух семейств: Pospiviroidae, представителем которого является веретенообразный вирус картофельных клубней (обратите внимание на – oid в названии семейства, это особенность обозначения вироидов), и Avsunviroidae, типичным представителем которого является вироид «загара» авокадо. После внедрения в растительную клетку, вероятно, через структуры плазмодесмосом соответствующие вироиды выбирают себе сайт для репликации. Посповироиды включаются в ядро, а авсунвироиды – в хлоропласт. Оказавшись в органелле-мишени, каждый вироид производит одно и то же, поистине замечательное действо: они мобилизуют клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу для осуществления своей репликации. В ядре посповироиды мобилизуют РНК-полимеразу II, которая обычно отвечает за транскрипцию всех кодирующих клеточные белки генов. В хлоропласте авсунвироиды используют кодируемую в ядре хлоропластную РНК-полимеразу. Геном реплицируется по механизму вертящегося круга (rolling circle) с образованием олигомерных репликационных интермедиатов, которые расщепляются на фрагменты нужной длины, а затем конформируются в кольцевидную форму. На этом последнем этапе вироиды двух семейств ведут себя по-разному: реплицирующиеся в ядре посповироиды мобилизуют клеточные ферменты для процессинга генома, а авсунвироиды «кодируют» рибозим в форме молота (Cech, 1993; Hutchins et al., 1986), который отвечает за автокаталитическое созревание геномной РНК. Через плазмодесмосомы вироиды перемещаются внутри растения между клетками, а на большие расстояния распространяются по сосудистой системе растений, вероятно, в комплексе с белками растения. Передача между растениями осуществляется разнообразными способами, часто с семенами или пыльцой, но самым эффективным способом является вегетативная передача. Зафиксированы примеры передачи между отдельными растениями тлями, и было также показано, что между кустами помидоров вироид веретеновидности картофельных клубней переносят медоносные пчелы (Florees et al., 2005). Многие аспекты репликации и патогенности вироидов остаются неясными, так же как их загадочная способность изменять субстратную специфичность РНК-полимеразы хозяина, позволяющая использовать ее не на ДНК-, а на РНК-шаблоне. Неизвестны также механизмы внутриклеточного транспорта; например, неизвестно, каким образом РНК авсунвироидов проникает в хлоропласт. Вероятно, самый таинственный аспект вироидной инфекции – способность вироидов вызывать самые разнообразные болезненные поражения у инфицированных растений. Является ли это результатом захвата важных клеточных функций? Вероятно, нет, потому что некоторые вироиды вообще не оказывают на инфицированные растения вредоносного влияния. Недавно выполненная работа позволяет предположить, что частная патология, вызываемая вироидами, обусловлена нарушением направленности антивирусной защиты самого растения, вызванным вироидом (Flores et al., 2005). С полной уверенностью мы можем заключить лишь, что генетическая информация, организующая весь репертуар репликационных стратегий и заболеваний, вызываемых вироидами (их фенотипы), заключена в 246–401 нуклеотид- одинарной цепи РНК. Эта РНК не кодирует ни одного белка. Представляется, что в клетках действует сама нуклеотидная последовательность; но как она действует? Должно быть, какие-то важные свойства заложены в первичной нуклеотидной последовательности вироида, которая, в свою очередь, обусловливает образование вторичной структуры путем свертывания РНК-генома в сложную трехмерную структуру, аналогично свертыванию последовательности аминокислот в трехмерную структуру белка.

Очевидно, что возможно прямое физическое взаимодействие вироидного генома с клеточными белками хозяина, и, соответственно, был предложен возможный механизм, опосредующий транспорт вироида веретеновидности картофельных клубней в ядро растительной клетки. Эта гипотеза подкрепляется фактом прямого и специфического связывания РНК вироида веретеновидности картофельных клубней с клеточным бромсодержащим белком, которое, как полагают, играет регуляторную роль в ремоделировании клеточного хроматина (Martinez de Alba et al., 2003). Образующийся в результате рибонуклеопротеиновый комплекс перемещается в ядро, где имеет место репликация вироида веретеновидности картофельных клубней и где, возможно, осуществляется влияние этого комплекса на регуляцию активности клеточных генов. Вероятнее всего, первичная нуклеотидная последовательность вироида получает преимущество как главное действующее лицо, определяющее патогенность вироида. Ответ растения-хозяина на репликацию вироида, как теперь известно, предусматривает посттранскрипционное подавление активности клеточных генов (Famens et al., 2008), развившийся в древности защитный механизм, нацеленный на проникшие в клетку нуклеиновые кислоты. Те же процессы участвуют в образовании нуклеотидных последовательностей специфических микро-РНК и малых интерферирующих РНК [small interfering RNA (siRNA)], которые участвуют в регуляции развития как растительных, так и животных организмов (Carrington, Ambros, 2003). Известно, что в растениях образуются siRNA, которые специфически сдерживают и тормозят репликацию вироидов, и ученые предполагают, что такие, нацеленные на вироиды siRNA могут играть роль в патогенности вироидов, влияя на транскрипты генов самой клетки. Несколько таких матричных РНК-мишеней уже описаны, но ученые пока далеки от понимания разнообразных механизмов, посредством которых эти крошечные РНК-геномы манипулируют клетками организма-хозяина (Gago-Zachert, 2016; Flores et al., 2015).