Уникальная способность вирусов к быстрому размножению и влиянию на эволюцию своих хозяев – это тема, которая красной нитью пройдет через всю эту книгу. Риновирусы и полиовирусы разделяют с другими РНК-содержащими вирусами одно свойство, которое отличает их от вирусов с ДНК-геномом: репликация РНК-содержащих вирусов совершается с множеством ошибок. РНК-зависимая РНК-полимераза РНК-содержащих вирусов отличается от ДНК-зависимой ДНК-полимеразы отсутствием механизма устранения ошибок. За редким исключением ДНК-полимеразы способны редактировать свои тексты, чтобы удостовериться в точности копирования, в то время как РНК-полимеразы удовлетворяются черновым вариантом. Следовательно, РНК-полимераза создает мутации и порождает генетическую вариабельность в дочерних геномах в степени, намного превышающей вариабельность ДНК-геномов, созданных под действием ДНК-полимеразы. Склонность к ошибкам копирования у РНК-полимераз так велика, что для вируса с геномом, состоящим из 10000 оснований, каждый дочерний геном будет содержать по меньшей мере один «неправильный» нуклеотид в сравнении с родительским геномом, а в сравнении с сестринскими – два (Malpica et al., 2002). Эта замечательная способность порождать генетическое разнообразие есть жизненно важная основа эволюционной адаптации, и в следующих главах мы увидим, как важен этот магический трюк РНК-содержащих вирусов для их успешности в роли паразитов и патогенов. Это противоречит здравому смыслу, но тем не менее это верно, что такая безалаберная репликация РНК-геномов является ценным достоинством РНК-вирусов.

Как правило, при обсуждении видов вирусов мы неявно подразумеваем, будто существует некий дикий штамм с уникальной геномной последовательностью, которая и определяет генетическую идентичность некоего исходного штамма. При инфицировании в реальном мире вирусная популяция представляется, скорее, как облако очень близких, но тем не менее генетически различных индивидов, которые получили название квазивидов (quasispecies). В каждом раунде инфицирования и передачи вирусные варианты отбраковываются или остаются под воздействием очищающего или положительного давления естественного отбора, и еще большее число вариантов создается по мере распространения и размножения квазивидов. Устойчивая популяция уникальных геномов, составляющих квазивиды, стала предметом многих экспериментов, теоретического моделирования и научных споров после того, как такая популяция была впервые описана в 1978 году учеными из лаборатории выдающегося молекулярного биолога Шарля Вейсмана в Цюрихе (Domingo et al., 1978). Новаторская работа Вейсмана с мелким РНК-бактериофагом Qβ, крошечным вирусом с геномом, содержащим всего 4500 оснований, заключалась в выяснении схемы его репликации в бактериальной клетке. Лаборатория Вейсмана стала, кроме того, первой, где была использована техника молекулярного клонирования генома Qβ для первой демонстрации сайт-ориентированного мутагенеза, то есть вызывания мутаций в определенных местах генома. В своей автобиографической статье Вейсман пишет, что открытие произошло во время проведения опытов по сайт-ориентированному мутагенезу в середине семидесятых годов, когда обнаружилось, что геномная последовательность фага Qβ быстро становится гетерогенной при выращивании в последовательности бактериальных культур: «Мы заключили, что популяция находилась в динамическом равновесии; жизнеспособные мутанты возникали с высокой скоростью… с одной стороны, а с другой – подвергались действию очень жесткого отбора» (2012).

Эти наблюдения имели далеко идущие последствия для наших знаний об эволюции РНК-содержащих вирусов. Вид вируса не является уникальной генетической единицей: он представляет собой сложную популяцию разнообразных, но родственных генетических сущностей, которые действуют как единое целое и, размножаясь, распространяются, откуда и возникло наименование «квазивид». Естественный отбор и эволюция вирусных видов действуют не на единичный индивидуальный генотип, но на совокупность генотипов, представленных в пределах квазивида. Индивидуальные генотипы являются производными случайных мутационных изменений, вызванных ошибочным включением рибонуклеотидов в цепь РНК во время репликации вирусного генома. Эти изменения подвергаются давлению естественного отбора, которое помогает выделять и отбирать относительно пригодные из индивидуальных компонентов и, таким образом, формировать генетический состав квазивида. Наша концепция «дикого типа» – это концепция отдельного, единичного вида, который обычно обладает геномом с «консенсусной последовательностью» и фенотипом, наилучшим образом приспособленным к преобладающим условиям окружающей среды. Понятие о диком типе сохраняет свою ценность для вирусологии, но дикий тип лучше считать неким центром тяжести квазивида, геном дикого типа может существовать в пределах квазивида, как нечто мимолетное и эфемерное, а в большинстве случаев он просто отсутствует. Надо особо подчеркнуть, что концепция квазивида ни в коем случае не отменяет дарвиновскую теорию эволюции, на которой она зиждется и дальнейшим развитием которой является.

Как мы скоро увидим, РНК-содержащие вирусы образуют квазивиды для осуществления быстрой адаптации, повышения шансов на распространение и стимуляции патогенеза в сложной физиологической среде клеток, тканей и органов, составляющих многоклеточные организмы. Основой формирования квазивидов, их движущей силой являются склонные к ошибкам механизмы репликации РНК-содержащих вирусов, которые служат генератором генетического разнообразия. Скорость генетической диверсификации, скорость, с которой ошибки включаются в новые геномы, должна тонко регулироваться эволюцией. Манфред Эйген, лауреат Нобелевской премии по химии, который позднее переключился на изучение теории информации и молекулярной эволюции, написал статью в 1993 году опубликованную в «Scientific American», где доступно и образно изложил свойства квазивидов. Автор говорил о пространстве последовательностей как о концепции, позволяющей картировать разнообразные нуклеотидные последовательности в многомерной матрице, названной пространством последовательностей Хеннинга. Если количество ошибок в репликации нуклеотидных последовательностей будет так высока, что ни один из дочерних вирусов не повторит родительскую последовательность, то популяция последовательностей равномерно заполнит все их пространство. Автор уподобил это молекулам газа, которые равномерно рассеиваются по объему контейнера, в который этот газ заключен. Строго говоря, это не будет репликацией, так как в этом случае целостность вида вообще перестанет существовать, даже при наличии давления отбора, который оставит только самые приспособленные генотипы. С другой стороны, снижение числа ошибок приведет к снижению дисперсии геномных последовательностей, как пишет Эйген: «При некотором критическом уровне ошибок действие отбора на популяцию разительно изменится: расширяющая сила мутаций придет в равновесие с ограничивающей силой давления отбора. Диффузный газ родственных последовательностей внезапно сконденсируется в конечный, но достаточно обширный оформленный объем» (Eigen, 1993). Это облако последовательностей со своим центром тяжести в области исходной последовательности станет самоподдерживающейся популяцией, которая будет несовершенно воспроизводиться, но поддерживать собственную цельность как единое целое.

Такова, следовательно, природа квазивида: плотность облака последовательностей в каждой точке пространства последовательностей определяется относительной приспособленностью последовательности; области облака, представляющие последовательности с меньшей адаптивностью, будут менее плотно заселены, а области с высокой адаптивностью заселены более плотно. В этом заключается наиболее мощное свойство вирусных квазивидов: плотность распределения вариантов адаптивности требует, чтобы последовательности были представлены с частотами, пропорциональными своей относительной адаптивности. Геномы с низкой способностью к адаптации будут реплицироваться мало или не будут реплицироваться вовсе, а наилучшим образом адаптированные геномы будут реплицироваться с наибольшей эффективностью. Отсюда следует, что с наибольшей вероятностью будут реплицироваться отличающиеся наибольшей адаптивностью геномы: их больше, и они претерпевают большее число репликативных циклов. Это может дать вирусам возможность осуществлять адаптивную эволюцию со скоростями, на несколько порядков более высокими, чем при истинно случайных мутациях. Последовательности быстро конденсируются около наиболее приспособленной области пространства последовательностей. Если изменятся условия окружающей среды, изменится и давление естественного отбора, и квазивид сможет воспользоваться присущим ему адаптивным потенциалом. Генотипы быстро перестроятся и начнут группироваться вокруг нового центра тяжести. Изменение ландшафта адаптивности пространства последовательностей, занятого квазивидом, является естественным следствием изменения давления отбора, действующего на популяцию вирусов. Такие изменения могут иметь следствием изменение иммунологического давления, производимого организмом-хозяином, применением антивирусных препаратов или даже передачей генетической информации другим видам, что требует приспособления вируса к новому хозяину. Частота генотипов, которые ранее занимали «центральное» пространство, зарезервированное за самыми приспособленными генотипами, уменьшится, и эти генотипы займут положение на периферии пространства адаптивности, если угодно, на самом краю облака последовательностей. В этом тоже заключается преимущество квазивида: он обладает памятью. Некогда самые приспособленные генотипы, свойства которых стали теперь дезадаптивными, могут продолжать существовать на границе пространства квазивида в роли минорных вариантов. При изменении внешних условий или давления отбора возможность призвать под знамена старые геномные варианты является большим преимуществом. Квазивиды могут быстро реагировать на изменения и адаптироваться, снова выбрав уже существующий вариант и быстро сгруппировавшись вокруг него, воссоздав оптимально приспособленный ландшафт последовательностей.

К настоящему времени накоплено немало экспериментальных данных, убедительно показывающих, что РНК-содержащие вирусы в ходе эволюции приобрели способность с выгодой для себя использовать склонность к ошибкам репликации. Совершенно очевидно, что должен существовать верхний предел склонности к ошибкам в работе вирусных РНК-полимераз. Хорошего может стать слишком много. При превышении некоего критического порога скорости появления мутаций в каждом геноме разнообразие перестанет быть благотворным; большинство дочерних геномов окажется нежизнеспособным. Чем больше геном, тем больше ошибок он может перенести в ходе своего синтеза до превышения какого-то критического порогового значения. В этот момент происходит катастрофа ошибок. Продолжая это рассуждение, можно понять, почему большинство РНК-содержащих вирусов имеют короткие геномы, меньше 15 тысяч оснований. Более длинные геномы не могут реплицироваться с надежностью, достаточной для предотвращения катастрофы ошибок (хотя я должен признать, что, вероятно, есть и другие ограничивающие факторы). Коронавирусы, имеющие геномы длиной свыше 30 тысяч оснований, являются исключением из общего правила. Тем не менее наше основополагающее рассуждение остается верным: максимальная длина генома РНК-содержащего вируса диктуется скоростью появления мутаций. В недавно выполненной работе было показано, что уникальность коронавирусов среди РНК-содержащих вирусов заключается в том, что они способны кодировать белки, повышающие надежность геномной репликации. Неструктурный белок 14 является 3’-5’ экзорибонуклеазой, которая обеспечивает точность репликации генома коронавирусов (Smith et al., 2015). Повышение надежности и точности репликации генома, в свою очередь, допускает экспансию генома и увеличение информационной емкости при сохранении способности к адаптивной эволюции.

Еще одним свидетельством в пользу того, что склонность к ошибкам при репликации геномов является эволюционным преимуществом РНК-содержащих генов, стало обнаружение нового мутанта вируса полиомиелита группой ученых Стэнфордского университета, которые опубликовали свою работу в 2003 году. Пфейффер и Киркегор выделили 3D-G645, мутантный вирус, кодирующий РНК-полимеразу с повышенной надежностью. Этот фермент делает меньше ошибок при синтезе РНК (Pfeiffer, Kirkegaard, 2003). Тот факт, что эта единичная точечная замена остатка глицина в полимеразе серином не произошла в ходе эволюции полиовируса, указывает на то, что в природной популяции вируса полиомиелита это простое изменение может лишить геном каких-то важных преимуществ. Представляется, что в обычных условиях РНК-полимераза вируса полиомиелита с низкой надежностью представляет какие-то преимущества перед лицом естественного отбора. Можно предположить, что создание геномного разнообразия, проявляющегося в форме квазивидов, обеспечивает преимущества вирусной популяции в условиях давления естественного отбора.

Группа ученых из Стэнфорда и еще одна группа из Калифорнийского университета в Сан-Франциско исследовали этот вопрос более подробно. Они смогли убедительно показать, как репликативная ненадежность и обусловленная ею множественность квазивидов благотворны для РНК-содержащих вирусов, особенно в таких сложных экологических условиях, как инфицированный животный организм (Pfeiffer, Kirkegaard, 2005; Vignuzzi et al., 2006). Обе группы исследовали патогенез вирусного поражения у инфицированных вирусом полиомиелита животных. В обоих случаях использовали генетически модифицированные породы мышей, восприимчивых к полиомиелитной инфекции. Ученые сравнили патогенез заболевания при заражении мутантным вирусом с надежной РНК-полимеразой, содержащей точечную мутацию G64S, и при заражении вирусом, содержащим РНК-полимеразу дикого типа. Мутантный вирус, который, как ожидалось, существует в виде квазивида пониженной сложности, проявил меньшую патогенность, и если вирусы дикого типа вызывали заболевание, которое практически во всех случаях поражало головной мозг, то мутантный вирус делал это с намного меньшей эффективностью. Ученые заключили, что сложная вирусная популяция, обладающая множеством генетических вариантов, имеет более выраженную способность вызывать заболевание у мышей. Полученные данные указывают на пользу квазивидов как таковых и на взаимодополняющую кооперацию между вариантами в пределах квазивида, которые максимально стимулируют патогенность вирусов для мышей. Сотрудники доктора Рауля Андино в Калифорнийском университете Сан-Франциско (Vignuzzi, 2006) показали, что при заражении природной болезнью полностью патогенным был только вирус, выделенный из головного мозга мышей. Этот вирус можно было ввести в периферические ткани здоровой мыши, что приводило к тяжелому инфекционному поражению и проникновению вируса в головной мозг. У мышей, инфицированных мутантным вирусом, поражением головного мозга страдало меньшее число животных, а вирус, который обнаруживали в мозге таких мышей, при введении в периферические ткани здоровых мышей в их мозге не обнаруживался. Мутантный вирус не мог создавать квазивиды, разнообразные настолько, чтобы проявлять полную патогенность после повторной инокуляции.

Вырисовывается картина, согласно которой создание геномного разнообразия в популяции полиовирусов очень важно для развития его патогенности для животных. Возможно, различные субпопуляции квазивида опосредуют разные аспекты патогенеза, например репликацию в кишечнике, транспорт между тканями или проникновение в нервную систему. Только вирусы, обладающие устойчивым и достаточным геномным разнообразием, могут проявлять полный спектр вирусной патогенности. Если это действительно так, тогда сложность или вариабельность исходов заболеваний, вызываемых РНК-содержащими вирусы, должны зависеть от способности вирусов создавать адаптивные популяции и проявлять высокую приспособляемость в организме каждого инфицированного хозяина. Сложные экологические системы, такие как внутренняя среда многоклеточного организма, представляют значительные трудности для вирусной популяции, и преодолеть эти биологические препятствия может только генетически разнообразная популяция вирусов. Передача вируса новому хозяину связана для популяции вирусов с необходимостью пройти через «бутылочное горлышко», в котором генетическое разнообразие оказывается сильно, хотя и временно, ограниченным. Эта ситуация обусловлена ограниченным числом вирусных частиц, которые передаются от одного хозяина другому в процессе заражения. Тем не менее если отсутствует измененное или специфическое давление отбора, то представляется вполне вероятным, что самый приспособленный и самый густо заселенный участок пространства последовательностей сумеет благополучно миновать это бутылочное горлышко. В организме нового хозяина эти популяции осуществляют новую экспансию (с повышением генетического разнообразия последовательностей) и воссоздают ее центр тяжести, откуда начинает свое построение облако последовательностей, из которых и состоит квазивид. Если основу новой инфекции составляют менее приспособленные геномы, то природные свойства квазивидов позволят диверсифицировать популяцию, изменить ее форму и сконденсировать вокруг предпочтительной области пространства последовательностей квазивида.

Огромная важность квазивидов в патогенности и эволюции РНК-содержащих вирусов была понята и по достоинству оценена только в течение последнего десятилетия. Квазивиды оказывают постоянное влияние на эволюцию всех РНК-содержащих вирусов. Сила давления отбора на эти вирусные популяции определяет стабильность или изменчивость последовательностей вирусных геномов с течением времени. Мощное давление очищающего отбора может сделать штаммы вируса относительно устойчивыми на протяжении достаточно длительных периодов времени (то есть занимающими четко ограниченные области пространства последовательностей), несмотря на высокую частоту мутаций. Для иллюстрации квазивида в действии я использовал пример вируса полиомиелита, но стоит в этой связи отметить, что естественные изолированные группы полиовируса весьма консервативны в своих нуклеотидных последовательностях. С другой стороны, для вирусов, на которые в большей степени действует положительный естественный отбор, благоприятствующий изменениям (например, это относится к вирусам, находящимся под высоким давлением отбора и вынужденным приспосабливаться к новому виду хозяев), характерна высокая генетическая изменчивость, усиливаемая сложным составом их квазивида. Таким образом, квазивиды обеспечивают вирус резервуаром генетического разнообразия, которое может проявиться в зависимости от условий существования. По мере того как мы исследуем разные вирусы и их эволюционный modus operandi, мы постепенно открываем новые мощные и хитрые трюки, используемые вирусами для того, чтобы перехитрить хозяина, улучшить собственную выживаемость и обеспечить бесперебойную репликацию.