Глава 8. Синтез генома M. mycoides

Многие считают, что самые важные создания человеческого гения – это результат какого-то провидческого дара, который ассоциируется с такими выдающимися и уникальными творцами, как Исаак Ньютон, Микеланджело, Мари Кюри и Альберт Эйнштейн. Я не сомневаюсь в огромном влиянии отдельных личностей, способных на громадные интеллектуальные скачки, видящих дальше, чем кто-либо до них, и замечающих закономерности там, где остальные видят только хаос. Однако есть также менее яркий вид созидательности, двигающий науку, скромная ее разновидность, которая не менее важна: умение решать проблемы. Преодоление одного препятствия для достижения одной очень конкретной цели может иногда давать на выходе технологию, которая, оказывается, имеет широчайший спектр разных применений. С очень ограниченного плацдарма науку можно подтолкнуть в новых неожиданных направлениях.

Когда, например, Хэмилтон Смит обнаружил, чтÓ именно в бактерии Haemophilus influenzae делает белок, который теперь называется рестриктазой, и как он это делает, вряд ли Хэм собирался основать генную инженерию. Когда британский генетик Алек Джеффрис увидел расплывчатый узор на рентгеновском снимке, который он сделал с генетического материала от одного из своих лаборантов, он даже подумал, что эта смазанная картинка проложит путь для ДНК-криминалистики, – но я сомневаюсь, что он представлял, до чего это дойдет, что она будет использоваться в установлении отцовства, для изучения популяций диких животных и, конечно, в расследовании преступлений. Когда Осаму Шимомура, переживший атомную бомбардировку Нагасаки, собрал с 1961 по 1988 год около миллиона медуз Aequorea victoria, чтобы выяснить тайну их биолюминесценции (белок, названный GFP), он вряд ли мог представить, что даст миру многоцелевую светящуюся метку, которая покажет в живом организме, как развиваются клетки мозга и как раковые клетки проходят сквозь ткани. Когда мы столкнулись с проблемой, которая задерживала нашу работу над синтетической жизнью, – генетический аналог попытки поставить ПО от Microsoft на «макинтош», – ее решение принесло дополнительный бонус: новый способ обращения с большими участками ДНК.

К тому времени в 2007 году мы уже выполнили успешные трансплантации генома, а также закончили трудоемкую сборку из лабораторных химикатов генома M. genitalium из 582 970 пар оснований. Мы создали синтетическую бактериальную хромосому и успешно вырастили ее в дрожжах. Мы также сумели выделить синтетическую хромосому из дрожжей, чтобы проверить ее секвенированием ДНК. Однако то, что мы использовали дрожжевые клетки как аппарат для финальной сборки химически синтезированных сегментов генома, означало, что нам приходилось растить нашу прокариотную (бактериальную) хромосому в эукариотной (дрожжевой) клетке. Чтобы завершить создание нашей синтетической клетки, нам нужно было изолировать синтетическую хромосому из дрожжей в такой форме, которую можно было бы трансплантировать в реципиентную прокариотную клетку.

Вот тут мы наткнулись на несколько непредвиденных проблем. Первая касалась конформации нашей синтетической хромосомы. Мы могли выделить ее в линейной и кольцевой формах для секвенирования ДНК, но, детально прорабатывая пересадку генома, мы обнаружили свидетельства того, что хромосома должна быть интактной, т. е. что ее ДНК не должна нести никаких порезов или «зазубрин». Наш метод очистки был слишком жестким, чтобы давать интактную ДНК. Мы успешно создали цифровую запись, но в таком формате, который не читался ни одним плейером.

Вторая проблема заключалась в том, что наша попытка расширить работы по пересадке генома в другой вид микоплазмы, M. genitalium, оказалась неудачной. Когда мы пересаживали геном M. genitalium в другие клетки того же вида, хромосома всегда рекомбинировала с уже имевшимся там геномом. Это была не единственная проблема. Как мы уже прекрасно знали, хотя геном у M. genitalium самый маленький, это не идеальный организм для разработки новых методов из-за его огорчительно медленной скорости роста. На то, чтобы вырастить колонии, каждый раз уходило до шести недель. Тем не менее мы с трудом, но продвигались. Пока шли эти эксперименты, мы решили, что, успешно пересадив геном M. mycoides в клетки M. capricolum, мы используем эти более быстро растущие виды для решения проблемы получения интактных хромосом из дрожжевых клеток. Нашим первым шагом было посмотреть, сможем ли мы клонировать полный геном M. mycoides в дрожжах. Эта цель казалась достижимой, учитывая наш успех в создании синтетического генома в искусственной дрожжевой хромосоме.

Эту задачу отдали постдоку Гвин Бендерс, работавшей с Клайдом Хатчинсоном. Крупные молекулы ДНК к этому времени рутинно и стабильно росли в дрожжах благодаря добавлению дрожжевого центромера – особого участка хромосомы, который можно видеть под микроскопом как сужение в хромосомах, когда во время деления клетки они образуют характерную Х-образную форму. Этот суженный участок – связующее звено хромосомы, которое играет важнейшую роль в гарантировании того, что, когда клетка делится, каждая дочерняя клетка наследует копию каждой хромосомы. Таким образом, когда центромер добавляется к большому куску ДНК, последний можно скопировать и разделить вместе с дрожжевыми хромосомами во время деления клетки. Этим методом мы могли выращивать кольцевые хромосомы. Молекулы чужой (экзогенной) ДНК можно было растить и в линейной форме, добавляя к ним теломеры – структуры, находящиеся на концах хромосом.

Опираясь на эту прошлую работу, мы разработали три разных подхода к клонированию полных бактериальных хромосом в дрожжах. В первом мы решили вставлять искусственный дрожжевой центромер в бактериальную хромосому перед тем, как растить ее в дрожжах. Во втором и третьем подходах мы всё делали одновременно: вставляли бактериальную хромосому и дрожжевой центромер с перекрывающимися последовательностями, что приводило к их рекомбинации в дрожжах. Все три подхода оказались вдохновляюще успешными, причем с несколькими бактериальными геномами, в том числе M. mycoides, H. influenzae и геномом фотосинтезирующей водоросли. Очень интересно, что единственное, что требуется для превращения бактериальной хромосомы в дрожжевую, – это добавление вместе с пригодным для селекции маркером маленького синтетического дрожжевого центромера. Теперь у нас был метод, который мы могли использовать для проверки нескольких разных способов трансплантации генома. Научившись стабильно клонировать геном M. mycoides в дрожжевые клетки, мы разработали процедуры для извлечения интактных хромосом в трансплантируемой форме.

Чтобы проверить геном M. mycoides, пропущенный через дрожжи, мы пересадили его, как раньше, в клетки M. capricolum. Однако проделав этот эксперимент много раз, команда не смогла получить никаких измененных клеток. Они провели контрольные опыты, используя геном, выделенный непосредственно из клеток M. mycoides дикого типа, и его удалось успешно трансплантировать, как и раньше. Я ждал результатов, и ко мне пришел Хэм Смит с обескураживающим вердиктом: «Геномные транспланты из дрожжей не работают». Видимо, источником проблемы были дрожжи, которые позволяли нам манипулировать длинными кусками бактериальной ДНК.

Мы с Хэмом Смитом уже обсуждали, что может отличаться в геноме M. mycoides, выращенном в клетках M. mycoides, от такого же генома, выращенного в дрожжевых клетках, поэтому во время видеоконференции между роквильской командой и группой в Ла-Хойе мы быстро сфокусировались на самой очевидной разнице. В клетках M. mycoides ДНК специфически метилируется (украшается молекулярными довесками, называющимися метильными группами). Эти группы, производные метана, состоят из одного атома углерода и трех атомов водорода (CH₃). Бактериальные клетки используют метилирование ДНК для защиты ее от нарезки собственными рестриктазами – добавляя метильные группы к тем основаниям ДНК, которые рестриктаза распознает. У дрожжей, однако, нету таких же рестриктаз и системы метилирования ДНК, а бактериальные метилазы вряд ли синтезируются в дрожжах из-за некоторых различий в генетическом коде. Мы подумали, что если геном M. mycoides в дрожжах действительно не метилируется, то при пересадке его в M. capricolum рестриктазы клеток-хозяев должны немедленно его разрушать.

Мы испробовали два подхода для проверки идеи, что причиной неудач трансплантации была неметилированность ДНК в дрожжах. В первый раз мы клонировали шесть генов, обеспечивающих метилирование ДНК у M. mycoides, чтобы получить ферменты, которые метилировали бы геном M. mycoides после выделения его из дрожжевых клеток. Этот метод оказался успешным: геном, выделенный из дрожжевых клеток, метилированный и пересаженный в бактериальные клетки, наконец заработал. Если бы мы метилировали геном M. mycoides экстрактом клеток M. mycoides или клонированными и очищенными ДНК-метилазами, то мы могли бы так же успешно пересадить их в клетки M. capricolum. Как окончательное доказательство того, что метилирование ДНК было решающим фактором, мы удалили из генома реципиента M. capricolum ген рестриктазы, рассудив, что если у клетки-реципиента нет рестриктаз, то мы сможем пересадить голую ДНК M. mycoides из дрожжей напрямую, без необходимости в защитном метилировании. В этом и было все дело, и вот теперь наконец-то мы вроде бы собрали все нужные компоненты для трансплантации синтетических хромосом.

Это краткое описание не отражает того, что решение проблемы метилирования на самом деле потребовало более двух лет тяжелого труда, но зато по ходу дела мы разработали очень мощный новый набор инструментов, который дал нам такие возможность манипулировать бактериальными хромосомами, каких не было никогда раньше. Большинство бактериальных клеток не имеет таких генетических систем, как гомологичная рекомбинация, имеющихся у дрожжей и E. coli. В результате внести серьезные генетические изменения в большинство бактериальных геномов очень трудно, если не невозможно. Это одна из причин, по которой большинство ученых работает с E. coli: они делают это просто потому, что с ней можно работать.

Однако теперь, добавив эукариотный (дрожжевой) центромер к прокариотному (бактериальному) геному, мы могли выращивать бактериальный геном в дрожжах, где он вел себя как одна из хромосом дрожжей. Это проложило путь к использованию дрожжевой системы гомологичной рекомбинации для проделывания многих и быстрых изменений в геноме. А потом мы смогли выделить модифицированный бактериальный геном, метилировать его, если необходимо, и трансплантировать в клетку-реципиент, чтобы создать новую клеточную версию. Это стало огромным прогрессом в генетических манипуляциях. До этого открытия ученые по большей части были ограничены возней с индивидуальными генами. Теперь для нас стало обычным делом оперировать наборами генов и даже целыми геномами. Мы опубликовали результаты в Science в сентябре 2009 года.

К тому времени мы разработали новые способы синтезировать молекулы ДНК в двадцать раз длиннее, чем было возможно ранее; мы разработали методику трансплантации генома из одного вида в другой и создания нового вида; и мы решили проблему модификации ДНК, предотвращающей разрушение ее рестриктазами. Нас и многих из тех ученых, кто следил за нашим продвижением, интересовало, сможем ли мы в итоге преуспеть в создании клетки, основанной на синтетическом геноме. Теперь, когда мы показали, что можем перейти от дрожжей к микоплазме, следующий шаг был перейти от синтетической ДНК в дрожжах к микоплазме. Мы были готовы, скомбинировав все эти новаторские подходы, творить историю. Но ту ли микоплазму мы взяли?

Поскольку мы достигли значительного прогресса в использовании дрожжей для манипуляции большими кусками ДНК, наши команды упорно продолжали свои попытки пересадить синтетический геном M. genitalium, но довольно безуспешно. Выглядело так, будто мы могли превратить более крупный вид M. pneumonia в M. genitalium пересадкой природного генома, но не могли достичь того же результата с синтетической версией. Наконец мы обнаружили, что реципиентные клетки M. pneumonia имеют на своей поверхности какую-то нуклеазу, которая съедает любую подвернувшуюся ей ДНК.

Но нас продолжал терзать чрезвычайно медленный рост клеток M. genitalium, сильно ограничивавший число возможных экспериментов. Для всех нас, а особенно для меня, ждать результатов неделями было не просто тяжело, а прямо-таки физически мучительно. Надо было что-то менять. Занимаясь метилированием ДНК и трансплантацией, мы одновременно придумывали более быстрый способ создания синтетической ДНК, технический прием, который дал бы новые возможности в нашей затее по трансплантации синтетической бактериальной ДНК. Как я уже писал, наши начальные этапы синтеза ДНК требовали нескольких шагов, начиная со сборки коротких олигонуклеотидов в конструкции покрупнее. Однако Дэн Гибсон чрезвычайно упростил этот метод, так что теперь у нас был одноступенчатый процесс.

Реакции сборки ДНК, которые использовал Дэн для своего нового метода, были очень сходны с теми, которые мы задействовали в нашей предыдущей работе, за исключением того, что он сделал важное открытие: все они могут проходить в одной пробирке и при одной температуре. Дэн сообразил, что экзонуклеазы, укорачивающие одну цепочку ДНК, не конкурируют с ДНК-полимеразой, которую мы использовали, чтобы дополнить ДНК второй цепочкой. Кроме того, когда все ферменты скомбинированы в одной реакционной смеси при 50 ºС, экзонуклеаза при такой температуре быстро инактивируется и поэтому может откусить как раз столько оснований, чтобы позволить фрагментам ДНК сплавиться друг с другом.

Эта работа была огромным прорывом по сравнению с нашим предыдущим подходом, нудным и трудоемким. Сила этой «Гибсоновой сборки», как мы ее назвали, – в ее великой простоте. До нее мы неохотно думали о повторении марафонских усилий, которых потребовало создание нашей первой синтетической хромосомы M. genitalium JCVI-1.0, из десяти тысяч кусков ДНК, не говоря уж о чем-то побольше. Исходно мы полагали, что самой трудной для решения проблемой будет химия синтеза генома; теперь же развитие технологии синтеза убедило меня в том, что надо существенно поменять направление программы.

Я поговорил с Хэмом Смитом и сказал, что мы неправильно подошли к проблеме. Поскольку мы, видимо, никогда не будем успешно работать – а скорее только мучиться – с медленно растущей M. genitalium, я сказал ему: «Я хочу, чтобы мы остановили все работы на ней и применили наши новые технологии для синтеза генома M. mycoides». Это было довольно нахальное требование, потому что геном mycoides вдвое больше genitalium. Но к этому времени мы знали, как пересаживать геном M. mycoides из дрожжей и как сделать клетки M. mycoides из клеток M. capricolum; а вооружившись сборкой Гибсона, мы теоретически могли собрать геном в 1,1 миллиона пар оснований относительно быстро.

Поначалу я столкнулся с сильным сопротивлением своей команды, и задним числом я не удивляюсь, что они приняли в штыки это радикальное предложение – не только начать всё сначала, но еще и нацелиться на более амбициозный объект. Дэн Гибсон, понятное дело, согласился с моим изменением плана, в то время как Хэм Смит и остальная команда хотели двигаться по прежнему пути, со знакомым набором проблем, но сконцентрироваться на поиске путей их разрешения, даже если это значило продолжать мучиться с медленно растущими клетками genitalium. Однако после нескольких раундов обсуждения, давших всем достаточно времени, чтобы обдумать мою идею, мнения стали меняться. Хэм пришел ко мне и сказал, что он согласен, что нам надо сменить направление; мы сразу же позвонили Дэну Гибсону и сказали ему, чтобы он начинал синтезировать геном M. mycoides.

Одной из причин, по которой команда сначала воспротивилась этому новому подходу, было то, что у нас в тот момент не было точной последовательности генома M. mycoides. Мы начали проектирование и синтез с того, что быстренько секвенировали две цепочки. Две наших последовательности генома из изолятов M. mycoides отличались друг от друга в 95 местах. Поскольку дрожжи теперь играли центральную роль в сборке синтетических геномов, мы выбрали последовательность из того изолята, который уже успешно клонировали в дрожжах и пересаживали в клетки-реципиенты.

Мы начали с проектирования 1078 кассет, каждая из которых включала 1080 пар оснований и перекрывалась с соседними на 80 пар.

Чтобы иметь возможность вырезать собранные последовательности из векторов, в которых они росли, мы добавили к кассетам еще одну последовательность на восемь оснований, опознаваемую рестриктазой NotI как место резки. Мы также добавили четыре «водяных знака», чтобы отличать наш синтетический геном от любых естественно возникших разновидностей. «Водяные знаки» занимали от 1081 до 1246 пар оснований; в них специально разработанным кодом были зашифрованы цифры и английские слова. Мы позаботились вставить последовательность «водяных знаков» в те участки генома, где они, как мы показали экспериментально, не повредили бы жизнеспособности клетки. Закончив проектирование, мы заказали 1078 кассет в Blue Heron, одной из первых ДНК-синтезирующих компаний, расположенной в Ботелле, штат Вашингтон. Компания собрала сегменты по 1080 пар оснований из химически синтезированных олигонуклеотидов, секвенировала их, чтобы убедиться, что они отвечают нашим спецификациям, и отправила их нам.

Теперь мы могли начать конструирование синтетического организма всерьез. Мы использовали иерархическое конструирование, которое шло в три этапа. На первом мы с помощью Гибсоновой сборки построили из кассет по 1080 пар оснований серию из 111 более длинных кассет, каждая около 10 тысяч пар оснований. Как всегда, точность была превыше всего, поэтому мы секвенировали все 111 и в девятнадцати нашли ошибки. Эти ошибки последовательностей были исправлены, после чего 10-килобазные клоны были пересобраны и пересеквенированы, чтобы проверить, правильные ли они.

Во втором раунде сборки генома мы собрали перекрывающиеся кассеты по 10 килобаз, чтобы сформировать кассеты по 100 000 пар оснований (которые мы тоже секвенировали, чтобы проверить свою точность). Наконец мы собрали получившиеся одиннадцать кассет по 100 кб вместе в дрожжах, чтобы получить последовательность в 1,1 миллиона пар оснований генома M. mycoides. Нам надо было еще раз проверить, что сборка работает, и мы использовали ПЦР и переваривание рестриктазами, чтобы подтвердить, что геном у нас построен правильно.

Наконец мы были готовы к попытке создания первой синтетической клетки посредством пересадки полного синтетического генома M. mycoides из дрожжей в реципиентные клетки M. capricolum. Как и раньше, успех должны были возвестить голубые клетки. Первая пересадка была проделана в пятницу, и мы напряженно ждали весь уикенд, чтобы посмотреть, не появятся ли к утру понедельника голубые клоны. Но понедельник пришел и прошел, не принеся никаких положительных результатов. Пересадку повторяли в две следующие пятницы, но снова никаких голубых колоний, только хмурые понедельники.

При взгляде назад ясно, что мы были очень близки к успеху, хотя тогда мы этого не чувствовали. После проведения всех контролей мы пришли к выводу, что мимо всех проверок, которые мы делали во время синтеза генома, как-то проскользнула ошибка в замысле или последовательности. Поскольку мы секвенировали ДНК, то предположили, что ошибка должна была быть в одной из исходных последовательностей, которые мы взяли за образец генома. Чтобы проверить наши последовательности, нам надо было создать биологический эквивалент того, что разработчик компьютерных приложений определил бы как отладочную программу. Операционная система современного компьютера обширна, в ней десятки миллионов строк кода, и в течение десятков лет инженеры разрабатывали умные отладочные программы, чтобы помочь находить ошибки.

Работу нашего биологического отладчика мы решили начать с проверки одиннадцати сегментов по 100 000 пар оснований. Мы сделали сегменты того же размера из природного генома M. mycoides так, чтобы можно было поочередно подставлять вместо каждого из них синтетический сегмент и смотреть, смогут ли они поддерживать жизнь. Из этих сложных экспериментов мы выяснили, что из одиннадцати синтетических сегментов по 100 килобаз все, кроме одного, совместимы с жизнью. Для окончательного доказательства Дэн Гибсон сконструировал гибридный геном с десятью синтетическими сегментами и одним природным и получил успешные трансплантаты.

Установив, который сегмент содержал ошибку или ошибки, несовместимые с жизнью, мы секвенировали ДНК еще раз – теперь высокоточным методом по Сэнгеру – и выяснили, что там выпала одна пара оснований. В таких случаях тривиальное сравнение нуклеотидов с буквами несколько сбивает с толку: кажется, что это так же мало влияет на понимание текста, как, скажем, написание «ошбка» вместо «ошибка». Но дело в том, что текст ДНК читается тройками нуклеотидов, каждой аминокислоте в белке соответствует комбинация из трех оснований – кодон. Это означает, что выпадение одного основания меняет всю дальнейшую генетическую последовательность: разбиение на кодоны в ней будет совсем другим, а значит, другой будет и последовательность аминокислот, которую этот участок ДНК кодирует. Это называется «мутация со сдвигом рамки»; в данном случае сдвиг произошел в важном гене dnaA, который способствует раскручиванию ДНК в начале репликации – без этого ДНК не может удвоиться. Это выпадение одного-единственного основания препятствовало клеточному делению и поэтому делало жизнь невозможной. Когда мы нашли критическую ошибку, мы смогли пересобрать сегмент в 100 кб правильно и использовать дрожжи для пересборки всего генома целиком. Теперь мы опять были готовы к попытке пересадки генома.

Как и раньше, решающий эксперимент был начат в пятницу, чтобы успешные колонии имели достаточно времени для роста и к следующему понедельнику выглядели бы как голубые точки. Дэн Гибсон сообщил нам имейлом о последней попытке:

В пятницу после обеда Дэн вручил маленький флакон своей коллеге Ли Ма, которая сидела под колпаком биозащиты – в одном из закрытых рабочих мест с сепараторным фильтром, которые мы использовали в наших лабораториях для работы в стерильных условиях. Флакон содержал маленький кусочек агарозы, в котором находилось несколько миллионов крохотных кольцевых ДНК – хромосом, каждая из которых содержала наш синтетический геном из 1 078 809 пар оснований. Это была синтетическая ДНК с 886 генами M. mycoides и с нашими «водяными знаками». Ли добавила капли фермента, который должен был растворить гель и оставить синтетические геномы, которые она затем добавила в другой маленький флакон, с реципиентными клетками M. capricolum и полиэтиленгликолем, делающим мембраны проницаемыми для ДНК. Ли распределила клетки на чашке Петри с красным агаром – составом, который будет питать новые клетки сахаром и аминокислотами. В агар был также добавлен тетрациклин, чтобы убить все клетки-реципиенты, которые не примут синтетический геном, и краситель X-gal, от которого новые клетки, содержащие трансплантированный геном, станут ярко-голубыми. Ближе к вечеру Ли поставила чашки Петри в инкубатор, чтобы держать клетки при постоянной температуре 37 градусов. Если новые клетки получились, то им понадобится пара дней, чтобы поделиться нужное число раз для превращения в один миллион дочерних клеток – маленькую колонию, видимую невооруженным глазом.

Все выходные я психовал. Тот миг, когда мы должны были увидеть, успешны ли наши модификации генома, казалось, отъехал в бесконечность. Наконец, очень ранним утром понедельника Дэн Гибсон трясущимися от предвкушения руками открыл дверцу инкубатора и начал по одной вынимать чашки Петри. Оставив лучшее на потом, он начал с контрольных (тех, которые должны были показать, что Ли Ма следовала правильной процедуре) и осматривал каждую на свет, чтобы проверить, видны ли уже колонии. Затем он перешел к тем, что содержали синтетическую ДНК. И там, почти в центре одной чашки, была одна – и только одна – ярко-голубая колония клеток.

Дэн остановился, чтобы оценить значительность момента. Поглядев на чашки Петри несколько минут, он поставил их все обратно в инкубатор и послал мне в четыре утра по Роквиллю простое сообщение: «У нас есть голубой трансплантат». Мы прошли такой долгий путь, потерпели столько неудач, столько лет ушло на пробы и ошибки, на решение проблем и изобретения. Наконец, кажется, усилия окупились.

Пока в Роквилле разыгрывался этот эксперимент, я находился в нашем таунхаусе в Александрии, в Виргинии, так что я был в той же временной зоне, что и Дэн. Мы скоро обменялись серией сообщений. Дэн снова написал: «Пока что появились одна или две голубых колонии с пересаженным полным синтетическим геномом! Еще рано точно подсчитывать количество трансплантатов, но я уверен, что это число возрастет. Мы посмотрим сегодня попозже и сделаем окончательный подсчет завтра». Нам надо было подтвердить, что голубая колония содержит только синтетическую ДНК. Я сказал Дэну, что буду в институте к десяти утра, и спросил, через сколько времени будут результаты первой проверки.

Я прихватил свою видеокамеру и пару бутылок шампанского и направился в Роквилль по мемориальной автостраде Джорджа Вашингтона. Сразу по прибытии я кинулся прямо в лабораторию, где встретил Дэна, сияющего и уже окруженного остальной командой. После нескольких теплых рукопожатий Дэн провел меня к инкубатору и вытащил чашку с культурой, чтобы показать мне первую голубую колонию. Мы сделали несколько снимков ее и осторожно убрали обратно в инкубатор то, что очень походило на первую жизненную форму с полностью синтетическим геномом.

Позже в тот день я получил первое подтверждение, что чашка с культурой содержит синтетический геном: «Поздравляем! Это официально. Вы гордый отец синтетической клетки mycoides!» Я собрал всю команду в актовом зале в Роквилле и передал наше видео остальной команде синтетического генома в Ла-Хойе. (Я удостоверился, что у команды в Ла-Хойе тоже достаточно шампанского на льду.) Хотя окончательная проверка результатов должна была занять еще несколько дней, мы все радостно подняли тост за наш очевидный успех.

Первое подтверждение поступило от Дэна в 7:45 утра вторника: «Хорошие новости. Все четыре последовательности – „водяных знака“ обнаружены на мультиплексном ПЦР в единственной колонии с пересаженным синтетическим геномом. В диком типе и негативном контроле M. capricolum, который не образовал колоний, „водяные знаки“ не обнаружены». Во вторник 1 апреля Дэн прислал результаты второго раунда экспериментов: «Полный синтетический геном опять трансплантировался. На этот раз он дал множество колоний! Вдобавок второй клон с синтетическим геномом тоже дал много колоний. Пойду отнесу шарик с надписью „С днем рождения!“ в рабочее помещение».

Прямо на следующий день мы получили еще более надежное подтверждение того, что новыми клетками управляет только синтетический геном: «Крутые новости! Трансплантат производит ожидаемые фрагменты, когда его режут рестриктазы AscI и BssHII». (Участки, которые вырезались этими рестриктазами, были добавлены к трем из четырех «водяных знаков».) 21 апреля мы получили результаты секвенирования ДНК живых синтетических клеток, и места сомнению больше не осталось: клетки управлялись только тем геномом, который мы спроектировали и синтезировали. Секвенирование показало, что в нашем геноме 1 077 947 пар оснований, точно как проектировали, включая 19 ожидаемых отличий от природного генома, а также четыре «водяных знака» – решающее доказательство того, что ДНК синтетическая. Точно, как мы и ожидали, выпадение одной буквы из более чем миллиона пар оснований ДНК предрешало выбор между жизнью и ее отсутствием. Я не могу придумать более яркую иллюстрацию той центральной роли, которую играет в жизни информация.

Мы вложили значительный труд в проектирование наших «водяных знаков», чтобы гарантировать, что мы можем надежно зашифровывать сложные сообщения в последовательности ДНК. В первом синтетическом геноме мы использовали однобуквенное обозначение аминокислот, кодируемых триплетными кодонами, чтобы зашифровать буквы английского алфавита. Например, триплет АТГ кодирует аминокислоту метионин, которую обозначают буквой М. Но поскольку букв в английском алфавите 26, а аминокислот всего 20, мы придумали более полную систему, которая позволяла нам закодировать весь алфавит вместе со знаками препинания, цифрами и популярными символами. (Строке ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[абзац][пробел]0123456789#@)(–+\=/:<;>$&}{*]” [%!’., соответствовала последовательность TAГ, AГT, TTT, ATT, TAA, ГГЦ, TAЦ, TЦA, ЦTГ, ГTT, ГЦA, AAЦ, ЦAA, TГЦ, ЦГT, AЦA, TTA, ЦTA, ГЦT, TГA, TЦЦ, TTГ, ГTЦ, ГГT, ЦAT, TГГ, ГГГ, ATA, TЦT, ЦTT, AЦT, AAT, AГA, ГЦГ, ГЦЦ, TAT, ЦГЦ, ГTA, TTЦ, TЦГ, ЦЦГ, ГAЦ, ЦЦЦ, ЦЦT, ЦTЦ, ЦЦA, ЦAЦ, ЦAГ, ЦГГ, TГT, AГЦ, ATЦ, AЦЦ, AAГ, AAA, ATГ, AГГ, ГГA, AЦГ, ГAT, ГAГ, ГAA, ЦГA, ГTГ.) Этот код был ключом к расшифровке «водяных знаков». В первый из них входили слова «J. Craig Venter Institute» и «Synthetic Genomics Inc.», имена нескольких ученых и послание: «Подтвердите, что вы расшифровали этот „водяной знак“, послав нам имейл (по адресу: [email protected])». Первый живой самовоспроизводящийся вид, имевший в качестве родителя компьютер, должен был получить свой электронный адрес.

В нашем первом синтетическом геноме мы были ограничены в создании сколько-нибудь содержательных сообщений аминокислотным кодом; теперь же, с новым кодом, я хотел отметить исторический момент включением каких-нибудь подходящих литературных цитат. Я нашел три, которые счел и значительными, и применимыми к первой синтетической форме жизни. Первая цитата должна находиться во втором «водяном знаке»: «Жить, заблуждаться, падать, торжествовать, воссоздавать жизнь из жизни». Это, конечно, из «Портрета художника в юности» Джеймса Джойса. Третий «водяной знак» включал, помимо нескольких имен ученых, вторую цитату: «Видеть вещи не такими, каковы они есть, а такими, какими могли бы быть», приписываемую первым учителям одного из физиков «Проекта Манхэттен» Роберта Оппенгеймера и приведенную в его биографии «Американский Прометей». Четвертый «водяной знак» содержал имена остальных 46 ученых и цитату из знаменитого физика, нобелевского лауреата Ричарда Фейнмана: «То, что я не могу создать, я не могу понять».

Мы совершили то, что почти пятнадцать лет назад было лишь дерзкой мечтой, и прошли по полному кругу. Начав с ДНК из клеток, мы научились точно читать последовательность ДНК. Мы успешно оцифровали биологию, превращая четырехбуквенный химический код (А, Т, Ц, Г) в двоичный электронный код компьютера (1 и 0). Теперь мы успешно прошли в обратном направлении, начав с компьютера и сотворив заново реальную молекулу ДНК, а потом в свою очередь создав живые клетки, которые, в отличие от всех, существовавших прежде, не имели естественной истории.

Исходное предположение (разделяемое по крайней мере большинством молекулярных биологов) состояло в том, что ДНК и геном, представленные последовательностью букв в компьютере, и есть информационная система жизни. Теперь мы замкнули петлю: начав с цифровой информации в компьютере и используя только ее, химически синтезировали и собрали воедино бактериальный геном, который был пересажен в клетку-реципиент, в результате чего получилась новая клетка, управляемая лишь синтетическим геномом. Мы назвали нашу новую клетку M. mycoides JCVI-syn 1.0 и стали готовить результаты к публикации.

9 апреля 2010 года я представил нашу рукопись с двадцатью четырьмя соавторами в Science. Мы известили Белый дом, членов Конгресса и представителей нескольких правительственных агентств до того, как статья была принята к публикации в следующем месяце, 13 мая.

В день ее выхода онлайн, 20 мая 2010 года (в бумаге статья вышла 2 июля), СМИ со всего мира собрались в Вашингтоне на нашу пресс-конференцию. Вместе с редакторами из Science мы объявили о первом работающем синтетическом геноме. Хэм Смит объяснил собравшимся, что теперь у нас есть средства для вскрытия инструкций к клетке, позволяющие установить, как она на самом деле работает. Мы также обсудили событие с более широкой точки зрения – а именно, что знания, полученные при выполнении этой работы, в один прекрасный день, несомненно, принесут пользу обществу, воплотившись во множество важных применений и продуктов, в том числе биотопливо, фармацевтику, чистую воду и пищевые продукты. Когда мы говорили об этом, мы на самом деле уже начали работать над способами получения вакцин и создания синтетических водорослей для превращения углекислого газа в горючее.