Глава 6. Первый синтетический геном

Стремление манипулировать жизнью в лаборатории прошло долгий путь от зари эпохи рекомбинантной ДНК в 1970-х, когда Пол Берг, Герберт Бойер и Стэнли Коэн начали резать и склеивать ДНК. К концу десятилетия появился лабораторный штамм E. coli, генетически измененный таким образом, чтобы производить человеческий инсулин. С тех пор ученые заставили бактерии делать человеческие факторы свертывания крови для лечения гемофилии и гормон роста для лечения карликовости. В сельском хозяйстве ДНК изменяли, чтобы сделать растения устойчивыми к засухе, вредителям, гербицидам и вирусам; чтобы увеличить урожайность и питательную ценность; для производства пластмасс; для снижения использования удобрений. Гены животных меняли, чтобы увеличить выход продуктов, создать модели человеческих болезней, сделать такие лекарства, как антикоагулянты, и получить «очеловеченное» молоко и свиные органы, которые можно пересаживать людям. Генно-модифицированные клетки использовались для производства белков, от антител до эритропоэтина, который повышает производство эритроцитов. Некоторые пациенты испытали на себе генную терапию, в ходе которой в геном некоторых клеток тела добавляется программная «вставка», чтобы лечить генетические нарушения: иммунодефицит, слепоту и врожденное свойство крови – бета-талассемию.

Сегодня генная инженерия превратилась в то, что более известно как синтетическая биология. Различие между биологией молекулярной и синтетической стерто, и в большинстве применений реальной разницы нет. «Синтетическая биология» просто звучит привлекательнее – точно так же физиология заместилась «биологией систем», а некоторые вполне традиционные химики предпочли переназвать свою работу нанотехнологией. Но как ни назови, а по всему земному шару множество ученых занимается генной инженерией, сочетая биологию с инженерными подходами.

Последние достижения слишком многочисленны, чтобы приводить их подробный список, но вот всего лишь несколько примеров генно-инженерных открытий. Рабочая лошадка молекулярно-биологических лабораторий, E. coli, была в 2003 году частично минимизирована (удалено 15 % ее ДНК) Фредериком Блаттнером из Университета Висконсина, пытавшимся сделать ее более надежной основой для промышленного производства. В Гарварде лаборатория Джорджа Чёрча разработала метод, названный MAGE – мультиплексное автоматическое проектирование генома, чтобы заменить кодон в тридцати двух штаммах E. coli, а затем побудить эти частично отредактированные штаммы эволюционировать так, чтобы получить клеточную линию, в которой этот кодон будет заменен во всех 314 позициях. В лаборатории Кристофера Фойгта в МТИ была собрана изощренная генетическая схема – будучи вставлена в бактерию, она может, например, сделать ее чувствительной к четырем разным онкомаркерам и заставить в присутствии всех четырех выпускать убивающий опухоль фактор. Коллега Фойгта Тимоти Лу разработал модули ДНК, которые могут выполнять логические операции. Такие живые вычислительные элементы, способные принимать решения, можно модифицировать для множества применений. По мере совершенствования технологии цели неизбежно становятся всё амбициознее и возникают новые вопросы, которые в свою очередь приведут к дальнейшему развитию технологии.

Наша предполагаемая работа по синтезу генома живой клетки требовала гораздо более глубокого понимания того, какие гены необходимы для жизни. Чтобы ответить на этот вызов, нам нужно было применить разнообразные приемы, как мы уже успешно делали раньше при секвенировании человеческого генома; успех в современной науке всё больше зависит от хорошей командной работы. Чтобы создать синтетическую клетку, мы запустили три большие программы. По опыту нашей работы с phi X 174 мы все решили, что наибольшего сосредоточения усилий требует синтез ДНК, если мы хотим провести его успешно. Поэтому первой командой стала группа синтеза ДНК, которой предстояло синтезировать полную бактериальную хромосому. Эту группу возглавлял Хэм Смит, а входили в нее Дэниел Гибсон, Гвинед Бендерс, Синтия Эндрюс-Фанкох, Евгения Денисова, Холли Баден-Тильсон, Джейшри Завери, Тимоти Стокуэлл, Анушка Браунли, Дэвид Томас, Миккель Элджир (Algire), Чак Мерриман, Ли Янг, Владимир Носков, Джон Гласс и Клайд Хатчинсон III. Я был уверен, что проблемы с химией разрешимы, и больше беспокоился о биологии. Сможем ли мы трансплантировать и установить синтетический геном, если преуспеем в его синтезе, и сможем ли мы лучше понять, какие гены составляют необходимый минимум для жизни? Поэтому вторая и третья команды сосредоточились на биологии. Команду трансплантации генома возглавлял Джон Гласс, в нее входили Кароль Лартиг, Нина Альперович, Ремберт Пайпер и Прашант Пармар. Командой минимального генома руководили Джон Гласс и Клайд Хатчинсон, и она включала Насиру Ассад-Гарсиа, Нину Альперович, Шибу Юсеф, Мэтью Льюиса и Махира Маруфа. Хотя состав всех трех команд частично перекрывался, каждая сосредоточенно занималась своей задачей. Руководителями всего проекта были Хэм, Клайд и я, а когда был учрежден Институт Вентера в Ла-Хойе и Хэм с Клайдом отбыли осваивать запад, роль общего лидера в Роквилле стал играть Джон Гласс.

Мы планировали синтезировать самый маленький известный геном, который может создать живую самовоспроизводящуюся клетку, M. genitalium. Мы думали, что этот синтез будет величайшей задачей и что он может позволить нам еще сильнее редуцировать маленький геном, определив по ходу понимания и препарирования генетических инструкций простой клетки минимальный для жизни набор генов. Для такого синтеза мы разделили геном M. genitalium на сто один сегмент, которые мы называли «кассетами», каждый примерно того же размера, что и геном phi X 174. Мы знали, что можем точно делать куски синтетической ДНК размером от пяти до семи тысяч пар оснований, и нам было нужно найти способ сочетать их так, чтобы реконструировать геном M. genitalium. Геном M. genitalium из 582 970 пар оснований был в двадцать раз больше, чем что-либо синтезированное раньше. До этой работы самыми большими синтетическими конструкциями из ДНК были два маленьких вируса и поликетидный генный кластер из 32 000 пар оснований. (Поликетиды – это кольцеобразные молекулы, которые в природе выделяют бактерии, грибы, растения и морские животные, чтобы убивать хищников; они служат основой для многих лекарств, особенно антибиотиков и противораковых агентов.)

Итак, нам было нужно разработать новый набор инструментов для надежного синтеза крупных молекул ДНК. Развитие инструментов и технических приемов – основа научного прогресса, но, на мой взгляд, не менее важна тщательность выполнения процедур. Мне часто приходилось описывать лабораторную работу в геномике взятым из информатики «мусор на входе – мусор на выходе»: если не соблюдать предельной тщательности при выполнении каждого шага, конечный результат будет в лучшем случае гораздо слабее, чем мог бы быть. Когда мы в 1990-х секвенировали первые геномы, мы обнаружили, что если наши библиотеки ДНК (содержащие небольшие фрагменты генома) были не высочайшего качества и не представляли собой истинно случайной выборки из всей ДНК в интересующем нас геноме, то шансов, что компьютер сможет использовать последовательности, сгенерированные по тем библиотечным образцам, для реконструкции последовательности генома, было очень мало. То же самое можно сказать об использованной для секвенирования ДНК, чистоте реагентов и воспроизводимости техник. Всё должно быть высшего качества. Моя команда обращала особое внимание на эти фундаментальные требования, и в результате мы оказались действительно способны получать очень высококачественные данные о последовательности ДНК.

Однако, как обсуждалось в 5-й главе, качество секвенирования ДНК, необходимое для чтения генетического текста, намного ниже, чем то, что требуется для написания текста, способного поддерживать жизнь. В первом случае нас устраивала точность не более одной ошибки на 10 000 пар оснований. Может показаться, что это очень мало ошибок, но использование этого стандарта означало бы, что у нас было бы около 60 ошибок в геноме M. genitalium и более 300 000 ошибок в человеческом геноме. Ясно, что столь неточные данные вряд ли смогут поддерживать жизнь и явно недостаточны для точного диагноза генных изменений у человека, ассоциированных с той или иной болезнью. Типичный человеческий ген может состоять из тысяч и даже миллионов пар оснований, поэтому данный уровень ошибок может означать множество ошибок секвенирования в одном гене. Чтобы представить, что это значит: всего одна ошибка в гене может вызвать серьезную болезнь, например серповидноклеточную анемию. Иными словами, такой уровень ошибок вряд ли можно считать приемлемым для реконструкции генома и создания живой клетки.

Эти простые факты часто забывают, фантазируя об оживлении вымерших видов по их секвенированным геномам. Журналистские рассуждения, вдохновленные великими достижениями палеогенетики – геномом неандертальца, прочитанным Сванте Паабо, или секвенированием ДНК шерстистого мамонта в Университете штата Пенсильвания, всегда сворачивают на возбужденные мечтания о воскрешении видов. Я прочел слишком много статей, бодренько обсуждающих восстановление неандертальцев или мамонта с помощью клонирования, хотя сиквенсы ДНК обоих созданий очень фрагментированы, не покрывают всего генома и – в силу глубокой деградированности – гораздо менее точны, чем те, что обычно получают при чтении свежей ДНК.

Тем не менее прочтение неандертальской ДНК было изумительным достижением науки, поведавшим нам многое о нашей собственной эволюции, установив, что скрещивание некоторых предков современных людей с нашими неандертальскими кузенами оставило нам в наследство 3–4 % нашего генома, восходящие к неандертальцам.

Чтобы синтезировать геном M. genitalium, нам требовалось чрезвычайно точное секвенирование ДНК. Проведенное нами секвенирование двух первых геномов в 1995 году опиралось на ранние модели секвенаторов ДНК, и хотя ошибок было меньше, чем одна на десять тысяч пар оснований, мы опасались, что такой точности может быть недостаточно для порождения живой клетки. Нам ничего не оставалось, кроме как пересеквенировать геном M. genitalium, используя новейшие технологии. Новый сиквенс показал, что наша исходная версия имела точность до одной ошибки на тридцать тысяч пар оснований, и когда мы скомбинировали старую и новую версии, то получили менее одной ошибки на сто тысяч пар – примерно с полдюжины на весь геном. И вот с этой новой высокоточной последовательности мы приступили к синтезу генома M. genitalium.

Наш успех с конвертированием цифровой записи генома phi X 174 в реальную ДНК придал нам достаточно уверенности, чтобы приняться за значительно больший геном свободно живущего организма. Умея производить с большой точностью отрезки размером с вирусный геном, мы понимали, что можем надеяться на успех, если сумеем разбить бактериальную хромосому на такие фрагменты и найдем надежный способ сшивания их всех вместе.

Мы нарезали геном микоплазмы на 101 кассету от пяти до семи тысяч пар оснований каждая. Кассеты были вырезаны так, чтобы каждая перекрывалась с соседними на 80–360 пар оснований, так что мы могли их накладывать друг на друга, как конструктор лего. Мы так спроектировали наши кассеты, что последовательности ДНК в зоне перекрываний были комплементарными: если последней буквой в одной кассете была Т, то она стремилась связаться с А в другой. Подобно застежке-молнии, перекрывающиеся участки сцеплялись между собой комплементарными основаниями, образуя спираль.

Наша попытка создать синтетический геном отличалась еще двумя особенностями. Во-первых, геном M. genitalium, как и phi X, кольцеобразный, поэтому мы спроектировали кассету № 101 так, чтобы она перекрывалась с кассетой № 1. Во-вторых, мы хотели, чтобы у нас был безотказный способ отличить наше изделие от природного генома M. genitalium. Чтобы исключить непонимание и двусмысленность, нам нужно было иметь возможность всегда проследить синтетический геном и неопровержимо доказать, что новой синтетической клеткой управляет именно он, а не примесь от исходной клетки или генома.

Мы хотели поставить подпись в новом геноме (как художники подписывают свои работы), чтобы отличать его от природного. И вот, использовав однобуквенные обозначения аминокислот, мы создали последовательности – «водяные знаки», которые читались как «Институт Вентера» и Synthetic Genomics, Inc., а также фамилии главных участников проекта. Мы использовали разные кодоны для представления каждой из двадцати букв аминокислотного «алфавита» (в нем представлены не все буквы латинского алфавита, поэтому, например, вместо U мы писали V). Мое имя, закодированное подобным образом, выглядит так:

TTAAЦTAГЦTAATГTЦГTГЦAATTГГAГTAГAГAAЦAЦAГAAЦГATTAAЦTAГЦTAA.

Эти «водяные знаки» были вставлены в пять разных кассет, разнесенных по геному. Нам также нужно было вставить ген устойчивости к антибиотику, что позволило бы нам избирательно убивать клетки, в которых нет нашего синтетического генома, и таким образом отбирать те, где он есть. Мы вставили ген устойчивости к антибиотикам внутрь ключевого гена M. genitalium – MG408, который нужен этой бактерии, чтобы прилипать к клеткам млекопитающих. Тем самым мы надежно искалечили этот ген, играющий важную роль в способности микроба вызывать болезнь, гарантировав, что синтетический организм будет безвредным.

Чтобы наша команда могла сосредоточиться на ключевом этапе – сборке 101 кассеты в геном, – я настоял, чтобы мы предложили трем компаниям, занимающимся синтезом ДНК, контракт на изготовление для нас 101 спроектированной кассеты. Несмотря на рекламные объявления, мы нашли только одну компанию, которая могла делать фрагменты в пять – семь тысяч пар оснований. Кроме того, это было дорого: синтез ДНК стоит примерно 1 доллар за каждую пару оснований, так что один сырой материал для нас должен был стоить больше полумиллиона долларов. Принимая на себя такое серьезное финансовое обязательство, мы были полны решимости заставить наших контрагентов работать.

Одной из главных трудностей было – как соединить 101 кассету. Первая идея пришла из наших прежних проектов по синтезу геномов. В результате наших попыток охватить как можно более широкое биологическое разнообразие я узнал о весьма примечательном организме, который мог восстанавливать свой геном после значительных радиационных повреждений. В 1999 году мы опубликовали статью «Полное секвенирование генома устойчивой к радиации бактерии Deinococcus radiodurans R1», в которой был описан геном необычного организма, способного выдержать до трех миллионов рад ионизирующей радиации. Если учесть, что смертельная доза такой радиации для человека – всего пятьсот рад, то как может Deinococcus переживать такую атаку? И нельзя ли приспособить те же механизмы репарации ДНК для построения синтетического генома?

Действие радиации на белки и ДНК всех видов примерно одинаково и отчасти связано с размером молекул. В начале своей научной карьеры я посвятил некоторое время определению размеров белков, инактивируя их радиацией. Методика в принципе проста. В белках радиация разрывает пептидные связи, которые соединяют составляющие белок аминокислоты; одного попадания в молекулу белка достаточно, чтобы лишить ее активности. Существует обратная зависимость между размером молекулы белка и дозой радиации, нужной для его инактивации путем разрыва пептидных связей (шанс попасть в крупную мишень гораздо выше, чем в мелкую), поэтому чем меньше белок, тем большая доза радиации нужна. Я использовал этот метод для определения размера белков-рецепторов нейромедиаторов и их функциональных комплексов.

Сходным образом радиация поражает и ДНК, разрывая химические связи, соединяющие нуклеотиды между собой. Как и в случае с белками, чем больше геном, тем ниже доза радиации, способная причинить разрушения. Из-за нашего большого генома люди намного чувствительнее к воздействию радиации, чем бактерии. Геном человеческой клетки в тысячу раз больше генома микроба: шесть миллиардов пар оснований против 1–8 миллионов пар у бактерий. Вследствие этого, чтобы разорвать обе цепочки в нашей ДНК, нужна значительно меньшая доза радиации, чем для бактериальной хромосомы. Поэтому мы можем быть уверены, что если нас угораздит попасть под ядерный армагеддон, то мелкие формы жизни его выдержат.

Так как выживает Deinococcus? Подвергаясь миллионам рад радиации, геном Deinococcus разбивается на сотни двухцепочечных обломков ДНК, но эти бактерии могут чинить и заново собирать свои хромосомы и продолжать реплицироваться. Его способность проделывать такое до сих пор полностью не понята, но в нее входят, в частности, множество копий каждой хромосомы, так что, когда его ДНК оказывается разорвана радиацией во множестве случайных мест, получившиеся фрагменты могут сами выстраиваться в нужном порядке, образуя матрицу ДНК. Я часто уподоблял этот процесс тому, который мы использовали в секвенировании дроблением, когда программа на мощном компьютере заново собирает секвенированные перекрывающиеся фрагменты ДНК, восстанавливая геном.

Мы рассудили, что если бы нам удалось воспроизвести процессы починки ДНК и сборки хромосом вне клеток Deinococcus, то мы могли бы использовать это для сборки нашей синтетической хромосомы из больших, размером с вирусный геном, сегментов ДНК. Двое наших сотрудников, Санджай Ваши и Рэйюань Чуан (Sanjay Vashee и Ray-Yuan Chuang), согласились заняться этой работой. Они перебрали весь геном Deinococcus в поисках всех генов, которые могли иметь отношение к делу, затем провели еще два года, клонируя каждый ген, чтобы получать «ремонтные» белки в лаборатории, где их можно было комбинировать так и сяк для повторения сборки и ремонта ДНК. После тяжких трудов мы были вынуждены сдаться. Мы уперлись в тупик и нуждались в новой стратегии.

Следующим подходом было разработать логичный пошаговый план сборки. Применяя специально предусмотренные перекрывания в последовательностях ДНК соседних кассет, мы собрали «в пробирке» две кассеты, чтобы получить фрагмент побольше. Затем мы клонировали этот более крупный фрагмент в E. coli, чтобы при ее размножении множились бы и копии крупного фрагмента. Таким путем мы могли получить достаточно много ДНК для следующего этапа сборки. Нашей конечной целью было не только получить геном M. genitalium, но и разработать продуктивный воспроизводимый процесс сборки, который мы в дальнейшем могли бы приложить к созданию любых синтетических геномов.

Наш план первого раунда сборки генома состоял в соединении четырех кассет, каждая размером примерно с геном phi X 174, чтобы создать кусок в 24 000 пар оснований. Для этого мы внесли равные количества каждой из четырех кассет в микроцентрифужную пробирку с векторной ДНК, позволявшей размножить этот свежесобранный сегмент в E. coli. Вектор, который мы использовали, называется искусственной бактериальной хромосомой (ИБХ). В ней один конец перекрывается с началом кассеты № 1, а другой – с концом кассеты № 4.

Чтобы связать куски вместе, мы добавили в смесь ДНК в пробирке фермент (3’-экзонуклеазу), который откусывает по нуклеотиду с конца ДНК, укорачивая лишь одну из двух цепочек ДНК (так называемую 3’-цепочку – это название связано с тем, как нумеруются атомы углерода в сахарах нуклеотидов ДНК) и оставляя другую цепочку (5’-цепочку) открытой. Управляя экзонуклеазой путем изменений температуры, мы могли гарантировать, что соответствующие одноцепочечные концы кассет найдут друг друга и слипнутся за счет химического притяжения комплементарных оснований на каждой цепочке, а-ля Уотсон и Крик.

Чтобы убедиться, что мы в итоге получим полные двуспиральные цепочки, мы затем добавили ДНК-полимеразу и свободные нуклеотиды, чтобы в любом месте, где 3’-экзонуклеаза откусила от цепочки слишком много, полимераза вставила недостающие основания на место. Кроме того, в смесь был добавлен еще один фермент, ДНК-лигаза, чтобы соединить перекрывающиеся концы. Когда все ферменты закончили свою работу, мы получили все четыре кассеты, сцепленные в куски из 24 000 пар оснований, или цепочки в 24 кб. Чтобы произвести все такие «укрупненные» кассеты по 24 кб, которые вместе составляют полный геном M. genitalium, мы повторили процесс двадцать пять раз.

Так как мы размножали синтетическую ДНК в E. coli, то у нас было достаточно ДНК для секвенирования. После проверки секвенирования всех 25 кассет мы повторили процесс in vitro, на этот раз соединяя три кассеты по 24 кб в кассеты по 72 000 пар оснований, то есть каждая кассета составляла одну восьмую от генома M. genitalium. Чтобы сделать это, нам сначала надо было освободить (с помощью рестриктазы) кассеты по 24 кб от вектора-ИБХ, который использовался, чтобы растить их в E. coli.

Наши векторы-ИБХ были сконструированы так, что на обеих сторонах нашей вставленной синтетической ДНК у них была последовательность из восьми определенных оснований. Эта восьмерка нуклеотидов, не встречающаяся в естественном геноме M. genitalium, распознается особой рестриктазой, называемой NotI. Когда NotI разрезает ДНК ИБХ, синтетический фрагмент в 24 кб освобождается. На этом этапе мы получили синтетическую ДНК, длина которой более чем вдвое превышала предыдущий рекорд для синтетических ДНК-сборок.

Следующим шагом было повторение процесса еще раз, теперь для получения сегментов по 144 000 пар оснований, каждый сегмент – четверть генома. Для этого две кассеты по 72 кб подвергались тому же процессу сборки in vitro. Однако тут мы вступали на неизвестную территорию и доводили нашу методику до предела. На предпоследнем этапе – получении сегментов в половину генома (290 000 пар оснований) путем соединения четырех четвертей в две половинки – мы уперлись в проблему: сегменты по 290 кб оказались слишком большими для размещения их в E. coli.

Это побудило нашу команду начать поиски других видов, способных устойчиво вмещать столь большие молекулы синтетической ДНК. Мы обратили внимание на Bacillus subtilis, которую использовала японская группа для выращивания больших сегментов генома цианобактерий. Но хотя B. subtilis действительно могла вместить большие сегменты по 290 кб, извлечь неповрежденную ДНК из этих клеток оказалось невозможно, так что мы стали искать дальше. Решение пришло из мира более сложных клеток – эукариот. Это был любимый экспериментальный объект ученых всего мира, изучающих биологию эукариот: пивные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Они веками применялись в виноделии и хлебопечении, а в лабораторной практике стали популярны благодаря относительно маленькому геному и ряду особенностей, облегчающих генетические манипуляции. Например, S. cerevisiae используют для так называемой гомологичной рекомбинации: если сегмент ДНК имеет на своих концах последовательности, сходные или идентичные концевым последовательностям какого-то участка в геноме S. cerevisiae, то этот сегмент можно вставить в геном дрожжей вместо «родного».

Нашим гуру по части дрожжей был Владимир Носков, научный сотрудник группы синтетической биологии и биоэнергетики в Институте Крейга Вентера в Мэриленде. Носков учился в Санкт-Петербургском государственном университете в России и потом продолжил образование там же, готовя диссертацию по генетике дрожжей. Проведя пять лет в Японии за изучением репликации хромосомальной ДНК и «контрольной точки» клеточного цикла дрожжей, где ДНК проходит контроль и починку, он затем работал в НИЗ в Бетесде. Там, в группе структуры и функции хромосом, Носков придумал несколько новых приемов для технологии манипулирования большими кусками ДНК в дрожжах – трансформационно-ассоциированного рекомбинантного (ТАР) клонирования, более совершенного, чем старый метод искусственных хромосом дрожжей (YACs).

Дрожжевые клетки, которые примерно в десять раз больше клеток E. coli, защищены толстой клеточной стенкой, препятствующей трансформации ДНК в клетке. Чтобы справиться с этим, ТАР-клонирование использует фермент зимолиазу, расщепляющий большую часть клеточной стенки, в результате чего образуется так называемый сферопласт, в который легче поместить большие куски ДНК. В результате ТАР-клонирования получаются кольцевые искусственные хромосомы. Они стабильны, а кольцевая структура позволяет легко очищать их от нормальных линейных хромосом дрожжей.

Мы обнаружили, что с помощью ТАР-клонирования мы можем стабильно растить наши большие конструкции из синтетической ДНК, а используя дрожжевую систему гомологичной рекомбинации – соединять наши перекрывающиеся сегменты-четвертушки в куски в половину генома. Затем эта система позволит нам собрать в дрожжах весь геном M. genitalium целиком. Таким образом перед нами замаячил конец долгого и трудного восхождения к первому синтетическому геному живого организма.

Мы вставили в дрожжевые клетки шесть кусков ДНК: ТАР-клонирующий вектор и пять соответствующих геному M. genitalium (четыре сегмента по четверти синтетического генома и еще один разделенный надвое сегмент для перекрытия мест ТАР-клонирования). Чтобы этот эксперимент сработал, надо, чтобы дрожжевая клетка приняла все шесть сегментов ДНК и гомологичной рекомбинацией соединила их между собой. Мы проверили размер ДНК в 94 трансформированных дрожжевых клетках и обнаружили, что в семнадцати из них содержится полный синтетический геном M. genitalium.

Казалось, мы преуспели в сборке нашего синтетического бактериального генома в дрожжевых клетках, но надо было еще секвенировать ДНК, чтобы проверить точность этого генома и убедиться, что процесс сборки прошел без ошибок. Это звучит просто, но нам пришлось разработать новые методы, чтобы извлечь нашу синтетическую хромосому из дрожжевых клеток, а она, по нашей оценке, составляла около 5 % всей содержащейся в них ДНК. Для очистки нашей синтетической ДНК мы, зная последовательности генома дрожжей и синтетического генома, подобрали рестриктазы, которые порезали на мелкие кусочки только ДНК дрожжей. Затем путем гель-электрофореза мы отделили расщепленные остатки дрожжевой ДНК от невредимой синтетической хромосомы.

Наконец мы могли использовать наш метод дробления для секвенирования синтетического генома. Мы все были очень довольны и вздохнули с облегчением, когда реальная последовательность ДНК точно совпала с той, что была записана у нас в компьютере, включая введенные нами водяные знаки. Мы синтезировали геном M. genitalium из 582 970 пар оснований и тем самым создали самую большую химически синтезированную молекулу с заранее заданной структурой.

Мы назвали нашу первую синтетическую хромосому M. genitalium JCVI-1.0. Мы описали наши результаты и послали их в Science 15 октября, на следующий день после моего шестьдесят первого дня рождения. Наша статья вышла на сайте 24 января 2008 года, а на бумаге – 29 февраля. Мы праздновали наш успех в создании генома, но знали, что главные задачи еще впереди: теперь надо было найти способ трансплантации первого синтетического генома в клетку, чтобы посмотреть, будет ли он функционировать как нормальная хромосома. В ходе этого клетка-хозяин должна трансформироваться в такую, где все компоненты будут произведены по инструкциям, заложенным в нашу синтетическую ДНК. И снова наши опыты будут строиться на более ранних работах и идеях целого ряда талантливых команд, работавших в течение многих предыдущих десятилетий.