Новогодние каникулы я провел в размышлениях: дела наши шли отнюдь не блестяще. Подсчитав, сколько нам потребуется костного материала, чтобы отсеквенировать полный геном, я получил десятки граммов. Столько не весили все имеющиеся у нас кости. Я чувствовал себя ужасно. Неужели я настолько безнадежный оптимист или просто сверх меры наивен? Что за идиотизм – верить в существование кости с бóльшим содержанием ДНК, чем в той первой кости из Виндии… Или я слишком понадеялся на 454, что она волшебным образом вытащит из рукава сверхмощную методику прочтения ДНК… Зачем я так лихо рискнул спокойствием и размеренной научной жизнью? Теперь я всего этого запросто могу лишиться.

Те двадцать пять лет, которые пришлись на мою работу в молекулярной биологии, были временем безостановочной технической революции. Те задачи, которые требовали в мои студенческие годы дней и недель изнурительного труда, теперь превратились в несложную процедуру: секвенаторы, пришедшие на современный рынок, выполняют ее за одну ночь. Трудоемкое и кропотливое бактериальное клонирование сменилось ПЦР, с помощью которой за несколько часов достигается результат тех прошлых многонедельных или многомесячных стараний. Вероятно, из-за этого я так легко решил, что за год-два мы сможем секвенировать в три тысячи раз быстрее, чем раньше, когда анализировались результаты для нашей концептуальной статьи в Nature. Действительно, с чего бы технологической революции останавливаться? За годы работы я усвоил, что в обычном случае, если речь не идет о сверхгениях, прорывы случаются, когда используются новейшие технологические достижения. Но это вовсе не означает, что мы должны становиться пленниками технологий и ждать, когда какое-нибудь изобретение чудесно разрешит наши трудности. Мы ведь можем немножко подсобить технологиям.

Я рассуждал так: если у нас мало костного материала и если в них ничтожное количество ДНК, то нужно хотя бы снизить потери ДНК на пути от экстракта к библиотеке. И после каникул на пятничном собрании я постарался донести до нашей группы чувство глубочайшего кризиса, в котором мы оказались. Я сказал, что на волшебную кость с кучей ДНК не осталось надежды и ничто чудесным образом нас не спасет. Мы должны использовать только то, что имеем, а это значит – заново переосмыслить каждый шаг лабораторных манипуляций. Например, что мы делаем при очистке ДНК-содержащих растворов? Ведь белков и других веществ в этих растворах совсем чуточка, а цена очистки – потеря большой доли ДНК. Если как-то минимизировать эти потери, то нам, может, и хватит имеющихся костей, и мы тогда дотянем до выпуска новых технологий 454.

Я неделю за неделей переспрашивал своих сотрудников, как именно они выполняют каждый из этапов работы с костями. Этот способ задавать один и тот же вопрос снова и снова я извлек из своего полузабытого юношеского прошлого, когда на военных сборах в Швеции нас учили допрашивать заключенных. И чем больше я спрашивал, тем больше приходил к убеждению, что при тщательной очистке вытяжек, предписанной протоколом 454, мы, по-видимому, теряем непомерно большую часть ДНК. И продолжал настаивать на осмыслении каждого шага этого протокола. А что еще оставалось делать?

В мои студенческие годы в молекулярной биологии вовсю использовались радиоактивные метки. Но потом во избежание обременительных мер предосторожности молекулярные биологи перешли к нерадиоактивным стратегиям. Потому теперешние студенты практически не имеют опыта работы с радиоактивными включениями. Однако при этом радиоактивные метки остаются наиболее чувствительным методом обнаружения даже ничтожного количества ДНК. И вот на одном из наших пятничных собраний я предложил Томи Маричичу пометить небольшое количество ДНК радиоактивным фосфором и использовать раствор для приготовления отсеквенированной библиотеки. А раствор с остатками ДНК, которые в обычных случаях выбрасываются, можно измерить на радиоактивность. Уровень радиоактивности покажет, сколько ДНК из раствора не пошло на секвенирование. Таким образом, можно напрямую измерить уровень потерь при очистке вытяжек.

Мой план, когда я изложил его на пятничном собрании, был встречен молчанием. Я сначала подумал, что все просто замерли в молчаливом восхищении перед изяществом и простотой моего решения. Но на самом деле в своем бездумном натиске я не принял во внимание, как живет моя группа. В подобном устройстве жизни кроется реальная сила исследовательской группы, но временами оно же оборачивается не на пользу делу. У нас принято было обсуждать любую идею, каждый мог свободно высказывать свое мнение, и в результате на собраниях мы приходили к общему решению, что и как нужно сделать. Но, как и в любой демократии, временами берут верх неразумные решения. На том собрании некоторые выказали решительный скептицизм. К их мнению в группе тогда прислушивались. К моему плану предъявили ряд претензий, вызванных, по-моему, подсознательным страхом перед малознакомыми методиками, к тому же старомодными и небезопасными, и вообще жуткими. Я решил не торопить события. Сначала обратиться к другим методам – попробовать оценить, сколько ДНК остается после каждой процедуры приготовления библиотек, и испытать новую технику для ПЦР. Но все это оказалось бесполезным – обычные методы показали слабую чувствительность или не годились по другим причинам.

Месяц за месяцем я продолжал настаивать на радиоактивном эксперименте, мое нетерпение росло, и я уже страстно жалел об ушедших временах автократии, когда слово профессора было законом. Но, стиснув зубы, соглашался, не желая разрушать атмосферу свободного обмена мнениями, которая, на мой взгляд, очень важна для дела.

И вот, когда все остальные способы были испробованы и отброшены, группа скрепя сердце согласилась. Томи неохотно заказал радиоактивный фосфор, пометил некоторое количество обычной человеческой ДНК, которую мы использовали для проверочных опытов, и потом проделал все процедуры по приготовлению вытяжек для секвенирования по 454. Результат получился ошеломительным. Он показал, что на первых трех этапах теряется от 15 до 60 процентов ДНК. Для биохимических процедур такой уровень потерь в принципе ожидаем. Но на последнем этапе, когда с помощью сильных щелочей разделяются комплементарные нити ДНК, потери против изначального количества достигают более 95 процентов. Естественно, для тех, кто работает с современной ДНК, все эти потери не имеют значения – материала у них полным-полно, так что даже 95- процентная потеря незаметна. А вот при работе с древностями она оборачивается полной катастрофой. Но раз проблема выявлена, то и решение нашлось. Чтобы разделить ДНК на одиночные нити, годятся не только щелочи. ДНК можно просто нагреть. Томи испробовал этот метод и обнаружил, что выход полученного для секвенирования раствора в 10–250 раз выше, чем при воздействии щелочами! С такими картами можно продолжать игру.

В большинстве лабораторий растворы после секвенирования выливают. А мы, к счастью, к этому большинству не относились. По моему настоянию мы сохраняли вытяжки от всех экспериментов – вдруг что новое изобретут, и они вновь пригодятся. Наверное, эта моя идея была наименее популярна среди лабораторного народа. В лаборатории стояли унылые ряды холодильников, забитые замороженными остатками экстрактов, и никому в голову не приходило, что они когда-либо будут использованы. Но спасибо нашим обстоятельствам – навязчивая идея профессора была реабилитирована. Теперь Томи оставалось только подогреть образцы растворов прошлых экспериментов с костями из Виндии и получить новые неандертальские ДНК, и относительно много, и без затрат на рутинные процедуры экстрагирования. Он так или иначе усовершенствовал и другие этапы приготовления библиотек. И в результате выработал пошаговую методику от костных вытяжек до растворов для секвенирования, в сотни раз более эффективную, чем прежние.

После обсуждения деталей проекта с хорватскими партнерами мы остановились на трех костях из Виндии – Vi-33.16 и двух других, Vi-33.25 и Vi-33.26. Все они, по-видимому, представляли собой осколки длинных костей, раздробленных, чтобы добраться до костного мозга (см. рис. 12.1). Благодаря усилиям Томи у нас появилась надежда получить только из этих костей 3 миллиарда нуклеотидов неандертальского генома. Но нельзя забывать, что в наших библиотеках по-прежнему содержалось не меньше 97 процентов бактериальной ДНК. Поэтому для команды из Брэнфорда путь до этой цифры – 3 миллиарда нуклеотидов – составлял от четырех до шести тысяч циклов секвенирования. Убедить Майкла Эгхольма выполнить такой объем работы даже думать не стоило.

Мне казалось, что мы намертво застряли, когда кто-то предложил поискать в трех хорватских костях “карманы” – области, в которых меньше бактериальной ДНК и, соответственно, больше неандертальской. Мы и раньше замечали, что в костях есть участки с большим или меньшим содержанием ДНК – вероятно, одни микрообласти казались бактериям более пригодными для роста, чем другие, и потому там бактерии размножались более интенсивно. Мысль обнадеживала, и Йоханнес принялся сверлить кости, чтобы найти наилучшие микрообласти. Он сверлил и сверлил – сначала кости стали похожи на флейту, затем на швейцарский сыр. Действительно, в некоторых участках мтДНК было в десять раз больше, чем в других, отстоящих на какой-то сантиметр. Но все равно – 4 процента неандертальской ДНК и не больше.

                                                                                               

 

 

Снова и снова мы возвращались к этой проблеме на наших пятничных собраниях. Там, на мой взгляд, концентрировался весь научный и социальный опыт: аспиранты и молодые специалисты знали, что их будущее, их карьера зависят от полученных результатов и публикаций. Поэтому они хитроумно изыскивали возможности провести ключевые эксперименты и вместе с тем избежать экспериментов дополнительных, связанных с общими нуждами, которые вряд ли войдут в громкие публикации с их авторством. Я смирился с мыслью, что начинающим ученым движут эгоистичные побуждения, и своей задачей видел соблюдение тонкого баланса между личными карьерными интересами молодого специалиста и общелабораторной линией и взвешивал всякий раз индивидуальные возможности каждого. Но когда неандертальский кризис накрыл нас с головой, я был восхищен, с какой легкостью личные интересы уступили групповым. Группа сплотилась в единое целое, где каждый, не ожидая награды и славы, рвался выполнить любое трудоемкое дело, только бы хоть немножко продвинуть проект. Царило чувство единения во имя общей цели, и все без исключения видели в ней великое, историческое предприятие. Я чувствовал, что собрал превосходную команду (рис. 13.1). Иной раз в приступе сентиментальности я ощущал любовь ко всем присутствующим и к каждому персонально. Из-за этого безрезультатность наших попыток казалась еще горше.

 

На пятничных собраниях весной 2007 года наша сплоченная группа показала себя с наилучшей стороны. Люди вбрасывали идею за идеей, одна безумнее другой, как увеличить долю неандертальской ДНК или найти “карманы” с наибольшим ее содержанием. Невозможно сказать, чья идея в конце концов сыграла, потому что мысли рождались на глазах, по ходу живейшего обсуждения, где все говорили и все принимали участие. Мы стали обсуждать, нельзя ли как-то отделить бактериальную ДНК от всего остального. Может, у бактериальной ДНК есть какое-то свойство, на которое можно нацелиться и оно сработает: ну, к примеру, размер бактериальных и неандертальских фрагментов. Но нет и нет – размер бактериальных фрагментов был таким же, как и неандертальских.

Но все же, все же чем отличаются бактериальные последовательности от ДНК млекопитающих? – спрашивали мы себя. И вот наконец меня осенило – метилирование! Метильные группы присоединяются к нуклеотидам, чуть-чуть химически изменяя их, но не саму последовательность. У бактериальной ДНК чаще метилируются аденины, а у млекопитающих метилируются в основном цитозины. Возможно, стоит попробовать подобрать антитела к метилированным аденинам и, таким образом, выделить бактериальную ДНК из экстрактов. Антитела – это белки, которые производятся иммунной системой, когда та узнает о внедрении чужеродной субстанции, например бактериальной или вирусной ДНК. Они циркулируют в крови, едва только обнаружат поблизости чужеродных агентов, накрепко связываются с ними и так помогают от них избавиться. Так как антитела строго специфичны, то есть связываются только с теми веществами, которые были предъявлены иммунным клеткам, они стали мощным инструментом в лабораторных работах. Например, если впрыснуть мыши метилированный аденин, то ее иммунные клетки распознают этот метилированный аденин как чужеродного оккупанта и произведут специфические антитела к метилированному аденину. Эти антитела можно потом выделить из крови мыши, очистить и использовать в лабораторных экспериментах. Я подумал, что мы можем изготовить такие антитела и попробовать с их помощью убрать бактериальную ДНК из вытяжек.

Быстрый поиск по литературе показал, что неподалеку от Бостона есть такая компания New England Biolabs, где исследователи уже синтезировали антитела к метилированным аденинам. Я написал Тому Эвансу, прекрасному ученому, который занимался репарацией ДНК и работал, как я знал, в этой компании. И он любезно прислал нам антитела. Теперь требовался доброволец из группы, который с их помощью попробовал бы связать бактериальную ДНК и удалить ее из вытяжки. Я надеялся, что таким образом мы сможем существенно повысить долю неандертальской ДНК. Задумка казалась мне весьма остроумной. Но когда я на собрании изложил ее нашей группе, она была встречена с изрядным скептицизмом. Я подумал, что дело опять-таки в неприятии незнакомых методик. Но теперь я припомнил им опыты с радиоактивностью. И таки настоял на своем. Эдриан Бриггс взялся за дело. Много месяцев он провел, пытаясь заставить антитела связываться с бактериальными фрагментами и отделить их от небактериальных. Он испробовал все мыслимые вариации методик. Так ничего и не сработало. Мы не понимали почему – и до сих пор не понимаем. Я уже стал привыкать к ехидным шуточкам по поводу гениальности своей идеи с антителами.

Но чем же еще эту бактериальную ДНК изничтожить, как от нее избавиться? Высказывалось предложение найти какой-нибудь часто повторяющийся мотив в бактериальных последовательностях. Тогда мы бы смогли с помощью синтетической ДНК связать эти мотивы и убрать бактериальную ДНК, примерно так, как мы пытались это проделать с антителами. Наш тихоня Кай Прюфер, студент-компьютерщик, который после появления в лаборатории самостоятельно выучил и стал понимать биологию генома лучше, чем любой студент-биолог, вызвался поискать такие потенциально полезные мотивы. И нашел. У него определилось несколько таких комбинаций из двух – шести нуклеотидов, которые гораздо чаще встречались у бактерий, чем в неандертальской ДНК, например, ЦГЦГ, или ЦЦГГ, или ЦЦЦГГГ и т. д. И когда он доложил об этом на собрании, то все вдруг стало на свои места. Конечно, как я об этом раньше не подумал! В каждом учебнике по молекулярной биологии так и написано: в геноме млекопитающих сравнительно редки такие сочетания нуклеотидов, где Ц идет за Г. А причина этого проста – у млекопитающих метилируются только те цитозины, за которыми стоят гуанины. Такие метилированные цитозины прочитываются ДНК-полимеразой с ошибками и в этом случае превращаются – мутируют – в тимины. В результате в течение миллионов лет эволюции в геноме млекопитающих постепенно становилось все меньше и меньше ЦГ-сочетаний. У бактерий, напротив, цитозины не метилируются, или это происходит редко, и поэтому ЦГ-мотивы у них обычны.

Можем ли мы как-то использовать это свойство? Ответ для нас всех был, естественно, очевиден. У бактерий имеются ферменты, так называемые рестриктазы, которые разрезают ДНК в местах с конкретными и специфичными мотивами, такими как ЦГЦГ или ЦЦЦГГГ. Если мы выдержим нашу неандертальскую вытяжку с набором таких ферментов, то они порежут бактериальную ДНК на мельчайшие кусочки, которые уже нельзя секвенировать, а неандертальская ДНК останется целехонька. И тогда та чуточка неандертальской ДНК увеличится относительно бактериальной, а нам того и нужно. На основе своего анализа Кай предложил коктейль из восьми рестриктаз, чтобы уж точно сработало. Мы немедленно обработали им одну из наших вытяжек этой смесью и отсеквенировали ее. Секвенатор выдал результат: 20 процентов неандертальской ДНК против обычных четырех процентов! А это значило, что теперь нужны не несколько тысяч циклов секвенирования, а только семь сотен. Для группы в Брэнфорде этот объем работы выглядел в пределах достижимого. Вот она, эта маленькая хитрость, сделавшая невозможное возможным. Единственный изъян методики виделся в том, что потеряются те участки, которые все же содержат мотивы ЦГ. Но их мы сможем выловить, используя различные наборы рестриктаз и сравнивая с результатами секвенирования без ферментов вообще. И вот мы представили наши наработки с рестриктазами Майклу Эгхольму в 454. “Блестяще!” – сказал он. Впервые мы почувствовали, что достижение нашей цели вообще реально.

 

А пока суд да дело, появляется статья молодого талантливого генетика Джеффри Уолла из Сан-Франциско, с которым мне несколько раз доводилось встречаться. Он сравнил 750 тысяч нуклеотидов из Vi-33.16, полученных нами по методу 454 и представленных в Nature, с 36 тысячами нуклеотидов, прочтенных группой Эдди Рубина по методу бактериального клонирования из наших экстрактов той же кости и опубликованных в Science. Уолл вместе с соавтором по имени Сун Ким указали на ряд различий, многие из которых мы уже обсудили при подготовке статей к печати. Они предположили, что дело может быть в недоработках методик 454, но, скорее всего, нужно винить современные загрязнения в наших библиотеках. По их расчетам, 70–80 процентов ДНК, которую мы считали неандертальской, нужно отнести к современной человеческой.

Расчеты настораживали. Мы знали, что загрязнения могут замешаться и в набор данных, опубликованный в Nature, и в библиотеки из Science, мы ведь отсылали экстракты в лаборатории, где не было необходимых стерильных условий нашей “чистой комнаты”. Также мы знали, что уровень загрязнений наверняка больше в данных по 454, если уж говорить о разнице в уровнях загрязнения двух наборов данных. Но при этом понимали, что в любом случае уровень загрязнений не может быть 70–80 процентов, потому что в основе расчетов Уолла лежало предположение о равном количестве Г и Ц в коротких и длинных фрагментах, а мы уже знали, что это предположение неверно.

Пытаясь прояснить ситуацию, мы попросили Nature опубликовать короткую заметку, а в ней указывали, что некоторые отличительные черты в наборах данных следует отнести за счет разницы в технологиях бактериального клонирования и секвенирования по 454. Кроме того, нелишне было бы вспомнить те дополнительные эксперименты по секвенированию, которые отражали крайне низкий уровень загрязнений. Но вдруг выяснилось, что кое-какие загрязнения были внесены в наши данные по 454, вероятно, из библиотек ДНК Джеймса Уотсона, которые как раз тогда и секвенировали. Так что в заметке мы ограничились высказыванием, что “уровень загрязнений может оказаться выше того, который определяется по мтДНК”. Но насколько выше, этого мы сказать не могли. Мы дали для читателей ссылку на статью Уолла и на ту, где мы описываем методику мечения библиотечных последовательностей, которая позволяет навсегда решить вопрос с загрязнениями вне наших “чистых комнат”. Еще дали ссылку на доступную базу данных геномных последовательностей, откуда любой желающий может взять данные и сам поразбираться с волнующими его вопросами. Я очень досадовал, когда после рецензирования Nature решил нашу заметку отклонить.

Мы обсуждали, стоило ли публиковать ту статью в Nature, не слишком ли мы поспешили. Не увлеклись ли соревнованием с Эдди? Может, стоило подождать? Некоторые говорили, что стоило, другие – что нет. Даже теперь, оглядываясь назад, я уверен, что тот прямой тест загрязнения по мтДНК не соврал, оно было очень низким. У анализа по мтДНК имеются свои ограничения, но, по-моему, прямые доказательства всегда перевешивают косвенные рассуждения. В той заметке, которую Nature так и не опубликовал, мы написали: “Никаких тестов на загрязнение по ядерной ДНК пока не существует, но чтобы получать надежные данные по древней ДНК, необходимо их разработать”. И в следующие несколько месяцев это стало главной темой наших пятничных собраний.