Хотя редактирование генома в описании Джорджа Чёрча выглядит довольно просто, сам процесс (что неудивительно) сопровождается серьезными техническими трудностями. Чтобы добиться успеха, редактирование генома должно быть избирательным. Никому не нужно, чтобы молекулярные ножницы беспорядочно кромсали геном и вставляли в него случайные участки ДНК. Это не только не повлияет желаемым образом на фенотип клетки (или животного, которое получится в результате) – неизбирательный разрыв нитей ДНК пагубно воздействует на клетку. Он вызывает нестабильность генома и зачастую приводит к раку.

Ключом к успешному редактированию генома стало открытие и усовершенствование различных типов программируемых молекулярных ножниц. Этот инструмент позволяет достичь избирательности, то есть возможности резать в тех местах, где нам нужно, и избежать разрезов, приводящих к гибели клетки.

Последние десять лет или около того преимущественно использовались два типа программируемых молекулярных ножниц (рис. 10): нуклеазы «цинковые пальцы», или ZFN (zinc finger nucleases), и нуклеазы TALEN (transcription activator-like effector nucleases – эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции). Нуклеазы ZFN и TALEN похожи в том отношении, что они обе являются гибридными молекулами, состоящими из двух отдельных частей. Первая часть (иногда ее называют «плечом») представлена белком, который опознает часть генома, требующую редактуры, и связывается с ней. Это программируемая часть: каждый «цинковый палец» распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, а каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. «Цинковые пальцы» или TALE объединяются в цепочки синтетическим путем, так что каждое звено опознает специфическую последовательность ДНК. Второй компонент гибридной молекулы – нуклеаза. Именно нуклеаза разрезает нить ДНК. Она присоединяется к одному из концов цепочки из «цинковых пальцев» или TALE. Для того чтобы внести одно изменение, синтезируются две гибридные молекулы: одна находит последовательность ДНК, расположенную перед целевым фрагментом, и связывается с ней, вторая делает то же самое с участком ДНК, расположенным после целевого фрагмента. После того как обе молекулы обнаруживают нужные места в геноме и связываются с ними, нуклеаза делает разрез.

Рис. 10. Нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN). Каждый палец в ZFN распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, в то время как каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. Плечи образуются при связывании нуклеаз с распознающими специфическую последовательность «цинковыми пальцами» или TALE, так что их последовательность соответствует геномной последовательности, к которой они должны присоединиться

Сделать разрез в нужном месте – это только первая половина работы. Вторая половина заключается в том, чтобы убедить клетку заменить в процессе починки только что поврежденного фрагмента ДНК слоновью версию участка геномной последовательности на мамонтовую.

В норме обрыв обеих нитей ДНК приводит к гибели клетки. Если же оборвалась только одна, ремонтные механизмы клетки могут восстановить любой недостающий участок, используя в качестве шаблона вторую нить. Если оборвались обе цепочки, не так очевидно, откуда клетка узнает, чем ей заменить утраченную последовательность.

Для решения этой проблемы в процессе эволюции возникло два механизма клеточной репарации. Первый называется гомологической рекомбинацией. Поскольку у каждой хромосомы в клетке существует гомологичная копия (одна хромосома от отца, другая – от матери), одну из них можно использовать в качестве шаблона для исправления ошибок в другой. При гомологической рекомбинации две гомологичные хромосомы выстраиваются друг напротив друга, позволяя механизмам клеточной репарации использовать генетическую последовательность неповрежденной хромосомы как образец для ремонта поврежденного участка. При вырезке и вставке мы пытаемся использовать этот механизм в своих целях. Одновременно мы хотим обмануть клетку, заставив ее вместо гомологичной хромосомы использовать в качестве шаблона синтезированный фрагмент ДНК (в нашем случае участок ДНК мамонта, доставленный в клетку вместе с молекулярными ножницами).

Второй механизм репарации двунитевых разрывов называется негомологичным соединением концов. Для работы этого механизма не требуется наличия гомологичной последовательности в качестве шаблона для репарации участка ДНК, вместо этого оборванные концы просто склеиваются между собой. Это не тот путь, по которому клетка должна пойти, если мы хотим изменить последовательность ДНК, но клетки часто используют такой механизм. Следовательно, одна из оставшихся трудностей заключается в том, чтобы разработать способ контролировать то, какой из механизмов будет задействован для репарации ДНК. Но пока что только часть отредактированных клеток получит новую версию гена, помещенную в нужное место в процессе репарации.

Нуклеазы ZFN и TALEN заслужили право считаться невероятно мощными молекулярными инструментами. Нуклеазы ZFN используются для исправления мутаций, вызывающих генетически обусловленные заболевания у людей, путем прямого редактирования геномной последовательности в стволовых клетках пациента. Эти модифицированные стволовые клетки затем можно пересадить пациенту, и они будут действовать как лекарство. Нуклеазы ZFN используются даже в разработке средства от ВИЧ/СПИД, при этом ген CCR5, кодирующий белок, с помощью которого ВИЧ проникает в Т-лимфоциты, редактируют таким образом, что вирус больше не может его использовать. Редактирование генома также используется для вставки генов устойчивости к гербицидам в геномы кукурузы и табака, а также для изменения коровьего генома таким образом, чтобы у коров вырабатывались человеческие версии различных белков крови и молока.

Применение ZFN и TALEN для редактирования геномов ограничено в основном необходимостью определять для них специфическую цель в геномной последовательности, что оказалось довольно сложно контролировать. При использовании более длинных зондов, созданных путем соединения большего количества «цинковых пальцев» или TALE, увеличивается специфичность, но более длинные белковые молекулы сложнее доставлять в клетку. Кроме того, создание зондов – это сложный процесс, требующий кропотливой работы, и на нее зачастую уходят месяцы и годы проб и ошибок. Со всеми этими проблемами мы уже сталкиваемся при работе с организмами, эксперименты с которыми давно ведутся в лабораториях молекулярной биологии. Если мы решим применить эти методы для восстановления вымерших видов, в экспериментах будут участвовать организмы, геномные последовательности которых нам неизвестны, на которых никогда не проводились исследования в области молекулярной биологии, что дополнительно увеличит сложность работы. Разумеется, эти инструменты для редактирования генома потенциально можно использовать для возрождения вымерших видов. Однако, глубже разобравшись в механизме их работы, мы вынуждены будем спуститься с небес на землю.