Приложения
“Нутро Америки” (American Gut)

Вы хотите узнать больше подробностей о собственном микробиоме? Определить свое место на подробной карте микрофлоры? Тогда у меня для вас есть предложение.

В 2012 году, вскоре после Дня благодарения (когда очень многие по необходимости вспоминают о том, что у них есть кишечник), мы с микробиологом Джеффом Личем основали проект, который назвали “Нутро Америки” – American Gut. Он открывает для широкой публики возможности тех технологий, которые мы уже прежде использовали в проекте “Микробиом человека”.

Прорыв, который произошел в последние годы в технологии ДНК-секвенирования, во много раз удешевил этот метод. Проект осуществляется в рамках “гражданской науки”, то есть с привлечением широкого круга добровольцев, которые необязательно должны иметь специальную подготовку. И сегодня мы можем предложить вам, заинтересованному гражданину и любознательному естествоиспытателю, возможность за весьма скромную плату принять участие в захватывающем исследовании. Пожертвовав проекту 99 долларов или более, вы можете проанализировать образец вашего микробиома. Если вы пожертвуете большую сумму, то вам будет доступна услуга, которую мы назвали “Неделя фекалий”. Цель проекта – разобраться, какие микробиомы существуют в каждом человеке.

Насколько нам известно, American Gut – наиболее крупный из краудфандинговых проектов “гражданской науки”. На момент написания этих строк в нем участвуют уже тысячи людей. Все данные становятся известны широкой публике – разумеется, на условиях анонимности каждого участника и максимально возможной защиты неприкосновенности частной жизни, – так что заинтересованные исследователи, преподаватели и просто любознательные люди могут воспользоваться этими данными. В отличие от обычных исследований, результаты которых очень долго, иногда годами, лежат под спудом в ожидании публикации, в нашем проекте все данные публикуются немедленно, что позволяет нам обнаруживать все новые виды различных взаимосвязей, и все они становятся предметом следующего, углубленного и тщательно контролируемого, исследования.

Масштабы проекта постоянно расширяются по мере того, как к нему присоединяется все больше и больше людей, желающих внести свои данные в картирование микробиома.

Так что не стесняйтесь, присылайте нам свои доллары (а также евро, йены или рубли – проект открыт для международных участников), мы вышлем вам набор для взятия образцов, и вы сможете отправить нам свои фекалии. Или просто подарите набор любимому человеку или коллеге – в конце концов, когда еще представится шанс узнать, из какого именно дерьма мы все состоим?

Если то, что вы слышали или читали о микробиоме, кажется вам слишком специальным или слишком противоречивым, то это потому, что микробиом и в самом деле не бином Ньютона. Он гораздо сложнее.

Причем одна из самых сложных задач – понять, а с чем, собственно говоря, мы имеем дело.

С точки зрения ДНК все люди, в сущности, одинаковы. Но на микробном уровне наши сходства быстро превращаются в различия. В одном и том же органе или части тела двух человек часто содержатся совершенно разные микробные сообщества (и даже если общие виды имеются, то их количество и соотношение существенно разнятся). Возьмите любых двух человек и исследуйте по одной микробной клетке из стула каждого из них. Только в одном случае из десяти окажется, что обе клетки относятся к одному и тому же виду. В то же время если вы сопоставите геномы этих же двух человек, то они совпадут на 99,9 %. Геном наших микробов не только гораздо разнообразнее, чем наш собственный, но и типы микроорганизмов у разных людей очень различаются.

На этом месте вы можете спросить: а откуда вы знаете, что наши микробы такие разные? Микроб – он и есть микроб. Lactobacillus – всегда Lactobacillus. Оказывается, не всегда.

Количество разновидностей микробов, которые удается обнаружить, зависит от способа исследования. Для определения разнообразия недостаточно простого подсчета отдельных видов. Дело в том, что количество видов, которые мы можем найти, тоже зависит от того, насколько старательно и тщательно мы ищем. Представьте себе, что вам нужно посчитать, сколько и каких именно рыб плавает в пруду. Если вам удалось выловить трех рыбок, это еще не дает вам оснований предполагать, что это и есть все население пруда. Если эти три рыбы – две форели и окунь, это еще не означает, что в пруду водятся только форели и окуни и что их соотношение непременно составляет два к одному. Ваш улов зависит от того, когда и как вы ловите и сколько раз вы забрасываете удочку или сеть.

Дело еще больше усложняется, когда мы пытаемся дать определение, что именно считать уникальным видом микроорганизмов. Когда речь идет о животных, это сравнительно легко: если два животных могут скрещиваться и давать способное к размножению потомство, то они по определению принадлежат к одному виду. Но микроорганизмы редко размножаются половым путем.

А когда это случается, то они могут обмениваться генетическим материалом не только между видами, но и еще гораздо шире: например, бактерии умеют скрещиваться и с другими бактериями, и с археями – и даже с эукариотами и вирусами. Это как если бы рыба могла скрещиваться с водорослями или с водомерками – насекомыми, живущими на поверхности воды! Тем не менее у бактерий нечто подобное происходит.

Есть еще одна проблема: очень немногие микроорганизмы готовы расти в лаборатории. Однако именно это требуется, чтобы вид получил официальное название и описание. Возвращаясь к рыбной аналогии: это все равно что выудить редкостную глубоководную рыбину, которая раздувается и лопается, прежде чем вы успеваете доплыть до берега и идентифицировать ее вид.

Правда, есть обходной путь. Пусть мы не можем вырастить многих микробов в лаборатории, но мы все равно можем выделить и проанализировать их ДНК и на основании этого решить, содержит ли их геном достаточно отличий, чтобы считаться отдельным видом. Мы также можем полностью отказаться от концепции вида и оценивать разнообразие по филогенетическому дереву – аналогу древа жизни, придуманному Дарвином и усовершенствованному Вёзе и Фоксом (см. стр. 8–9); микробное сообщество, которое занимает большую часть дерева, считается более разнообразным. Это полезный подход, потому что он позволяет назвать пруд, в котором обнаружено три вида форели, менее разнообразным, чем тот, в котором водятся форель, окунь и пескарь.

Наконец, вы должны решить, интересует ли вас только общее число видов, или вы хотите узнать, сколько особей каждого вида имеется в наличии в данной системе, и таким образом оценить количественное соотношение популяций. Почему это важно? Потому что если вы будете учитывать только количество видов, то пруд, в котором плавают одна форель, один окунь и тысяча пескарей, будет считаться таким же разнообразным, как тот, где насчитывается только по одному представителю каждого вида. В зависимости от того, какой аспект существования экосистемы вы рассматриваете, этого может быть и достаточно. Но в некоторых случаях – нет. Определяя, что считать разнообразием в конкретной экосистеме, приходится принимать множество решений.

Далее, вы можете захотеть сравнить между собой две экосистемы – два разных микробных сообщества. Для этого микробиологи используют метод уникального (индивидуального) фракционирования, или UniFrac, который позволяет изучить историю эволюционных изменений, разделивших эти два сообщества.

Кэти Лозьюпоун, одна из моих первых студенток, а ныне профессор медицинской школы Аншуц при Университете Колорадо, разработала этот метод и очень элегантно изложила его в своей докторской диссертации. Вначале мы наносим микробное сообщество на филогенетическое древо. Затем, используя статистический метод анализа главных компонент, вычисляем количество возможных вариантов отличия одних микробных сообществ от других.

Если вам это кажется китайской грамотой – или вы слишком давно изучали линейную алгебру (если вообще изучали), – не пугайтесь. Существуют компьютерные алгоритмы, которые делают эти вычисления за нас. Главное, что этот метод позволяет получить точную карту связей между микробными сообществами и выявить похожие сообщества, соседствующие на древе жизни.

Имея эту информацию, мы можем связать микробиом с конкретными заболеваниями. Чаще всего мы используем для этого кросс-секционный анализ: отбираем группу больных и группу здоровых людей и затем сравниваем их микробиомы. Кросс-секционные исследования позволили установить связь между кишечными микробами у людей и ожирением диабетом первого и второго типов, воспалительными заболеваниями кишечника, синдромом раздраженного кишечника, раком толстого кишечника, заболеваниями сердца, ревматоидным артритом и целым рядом других расстройств. Кросс-секционные исследования очень информативны, потому что когда мы выявляем значительные отличия между больной и здоровой группами, то понимаем, что за этим что-то кроется. Чтобы выяснить, действительно ли различные микроорганизмы вызывают определенные заболевания, необходимы дополнительные исследования.

“Золотой стандарт” кросс-секционных исследований – построение прогностической модели. Используя такую модель, можно взять данные некоторой выборки людей – больных или здоровых – и предсказать, больна или здорова остальная часть группы. Что и было успешно проделано для диабета, ожирения, воспалительных заболеваний кишечника. Интересно, что конкретные биомаркеры (виды микроорганизмов или гены, связанные с болезнью) в разных популяциях отличаются, например шведские от китайских при диабете второго типа. Таким образом, было бы преждевременно связывать определенные организмы с определенными болезнями на основании того, что мы узнали из кросс-секционных исследований, потому что то, что мы считаем патогеном, в разных популяциях может варьироваться.

Уникальность проекта “Микробиом человека” состоит в том, что он направлен в большей степени на здоровых, чем на больных. Проект позволил выявить, что на удивление большое количество тщательно проверенных здоровых добровольцев – до 30 процентов – являлись носителями микробов, которые считаются опасными патогенами, в том числе Staphylococcus aureus – золотистого стафилококка. Эти люди были, без сомнения, здоровы, что заставляет предположить, что многие из нас являются носителями организмов, которые вызывают болезнь только при определенных условиях. Вспомните о сорняках: они представляют проблему, только если растут там, где не должны расти. И это подсказывает нам, что, может быть, стоит переключиться с вопроса “Какие микробы “плохие”, как избежать контакта с ними или избавиться от них?” на вопрос “Почему одни и те же микробы безвредны для одних людей, но смертельно опасны для других?”.

Получив некоторое представление о том, какие микробы могут быть связаны с теми или иными заболеваниями, мы можем планировать длительное (его еще называют динамическим или продольным – в отличие от кросс-секционного, то есть поперечного) исследование. В ходе подобного исследования мы наблюдаем за одними и теми же людьми в течение долгого времени. Исследователи используют длительные исследования, когда хотят изучить слабые влияния, которые вызывают изменения микробиома у одних людей и в то же время совершенно не влияют на других. На сегодняшний день существует на удивление мало динамических исследований микробиома. Тем не менее мы рассчитываем, что их количество будет возрастать по мере дальнейшего снижения стоимости секвенирования ДНК.

“Золотой стандарт” динамического исследования – это перспективный когортный метод. Он состоит в том, что для участия привлекаются люди либо здоровые, либо еще не начавшие лечиться (в противном случае исследование называется интервенционным). Вы спросите: разве можно предсказать, кто из них заболеет и на кого подействует лечение? На момент написания этих строк ни одно из этих исследований не было достаточно обширным, чтобы получить окончательные выводы, хотя проект TEDDY (изучающий факторы окружающей среды, которые определяют диабет первого типа у молодых) в настоящее время обрабатывает данные о тысячах детей с риском развития диабета.

Перспективные когортные исследования, особенно долговременные, помогают выяснить, создает ли определенный микробиом угрозу развития болезни и подействует ли лечение на конкретного больного.

Существует еще один вид исследований – изучение механизмов. Подобные исследования обычно проводятся на мышах (по причинам, которые сейчас станут понятны) и позволяют нам выяснить, как именно работает конкретный биохимический механизм. Обычная методика такова: мы изменяем гены мышей; вводим им препарат, который, как мы считаем, будет иметь определенный эффект; добавляем или удаляем бактерии; проверяем и анализируем последствия. К сожалению, необходимое условие этого метода – умерщвление мышей с последующим исследованием их внутренних органов.

Одна из наиболее успешных и информативных методик изучения механизма состоит в том, что мышей выращивают в стерильном боксе, где нет никаких микробов. Затем им можно ввести определенные микробы и проследить за изменениями. Благодаря этим так называемым гнотобиологическим мышам (от греческого слова “гносео” – “знать”, потому что мы точно знаем, какие микроорганизмы с ними взаимодействовали) мы узнали, какие микроорганизмы влияют на ожирение, демиелинизацию нейронов (эродирование защитной оболочки нервов) при рассеянном склерозе, а также вызывают поведенческие расстройства, напоминающие аутизм. Правда, никогда не нужно забывать, что то, что действует на мышей, необязательно действует на людей. Тем не менее эксперименты на мышах все равно дают нам бесценную информацию.

Многое из того, что вы слышите о микробиоме и болезнях, может показаться вам запутанным, противоречивым, а иногда и преувеличенным. Чему верить? Стараясь разобраться, действительно ли микробы могут вылечить ту или иную болезнь, ищите положительные результаты, сопоставляя многие исследования, особенно такие, где проблема рассматривалась под разными углами. Результаты таких исследований с большей вероятностью окажутся правдивыми, так же как и результаты исследований с большим числом участников. В целом можно сказать, что пока у нас есть скорее корреляция между определенными микробами и определенными болезнями, подкрепленная пониманием предполагаемых механизмов (чаще всего эти результаты получены на мышах), а не четкая причинно-следственная связь.

Кроме того, результаты исследования в огромной степени зависят от методики его проведения. Например, если мы изучаем синдром раздраженного кишечника, в достаточной ли мере мы сузили круг участников? Мы ищем только больных СРК, страдающих от газов? Или от боли? Или тех, кто болезненно реагирует на определенные продукты? В случае изучения ожирения мы должны поинтересоваться резистентностью наблюдаемых к инсулину, тем, как именно жир распределяется на теле, и так далее.

Другие факторы, которые нужно принимать во внимание при сравнении результатов разных исследований: методы хранения проб; методы экстракции ДНК из образцов кала; какие именно фрагменты генома рассматриваются для идентификации; какой именно аппарат используется для секвенирования ДНК; какое программное обеспечение используется для анализа данных, и даже точные установки этих программ. Чтобы не упустить возможные слабые влияния, необходимы высокие стандарты методов.

Если все это звучит сложно, то это потому, что микробиом – сложная штука. И поэтому его исследование требует вдумчивого и взвешенного подхода. Об этой сложности стоит вспоминать всякий раз, когда вы слышите головокружительные заявления по поводу микробиома или вам предлагают простые решения по его улучшению и исправлению. В таких случаях не забывайте спрашивать: а кто это утверждает и откуда он или она это знает?

В конце концов, вы же не станете доверять ученому-ракетчику, обещавшему доставить вас на Марс, если он даже не сможет сказать вам, на каком расстоянии находится Красная планета!