Став консулом, Ливингстон отказался от скучной миссионерской деятельности и занялся научно-исследовательской работой. Он сознательно поставил ее на службу колониальной экспансии Великобритании, так как ошибочно полагал, что при британском господстве прекратятся истребительные межплеменные войны и охота за рабами, а проникновение английского капитала в Африку расценивал как прогресс. В мае 1858 г. он с женой, сыном и братом, Чарлзом Ливингстоном, приехал в Восточную Африку. В начале 1859 г. он исследовал низовья Замбези и ее северный приток Шире, открыв ряд порогов и водопад Мерчисон, а в апреле в бассейне этой реки обнаружил и описал озеро Ширва. Оттуда в сентябре он прошел к южному берегу озера Ньяса и выяснил, что оно имеет глубину более 200 м (по последним данным до 706 м). В сентябре 1861 г. Ливингстон повторил посещение озера и прошел по западному берегу примерно до 11° ю.ш., а Ч. Ливингстон на лодке вдоль того же побережья достиг 11°20' ю.ш. Далее на север проникнуть не удалось — помешали враждебное отношение приозерных жителей и начавшийся период штормов. По результатам съемки Ливингстон составил первую сравнительно верную карту Ньясы: водоем вытянулся почти по меридиану на 400 км (истинная длина оказалась значительно больше — 580 км).

Мери Моффет-Ливингстон, болевшая тропической малярией, умерла на Замбези 27 апреля 1862 г. «Ночью сколотили гроб, на другой день под ветвями большого баобаба вырыли могилу, и маленькая группа сочувствующих соотечественников помогла убитому горем мужу похоронить покойницу» (Ч. Ливингстон). Братья Ливингстоны продолжали путешествие до конца 1863 г. и выяснили: отвесные берега озера, казавшиеся горами, в действительности представляют собой края высоких плоскогорий. Итак, верно описав впадину Ньясы, они продолжили открытие и изучение Восточно-Африканской зоны разломов — гигантской меридиональной системы сбросовых впадин. Вернувшись в Англию, они в 1865 г. выпустили книгу «Рассказ об экспедиции на Замбези и ее притоки и об открытии озер Ширва и Ньяса в 1858–1864 гг.».

В 1866 г. Д. Ливингстон высадился на берег Восточной Африки против Занзибара и в апреле прошел на юг до устья р. Рувумы. Оттуда он повернул на запад, вверх по реке, и от ее верховьев вышел к Ньясе. Обогнув озеро с юга и запада, он в начале апреля 1867 г. достиг южного побережья Танганьики, а в 1868 г. обследовал западный берег этого озера. Много лет Ливингстон болел малярией и к этому времени так ослабел и исхудал, что «превратился в мешок с костями», и большую часть пути его пришлось нести на койке. Тем не менее он продолжал исследование и к юго-западу от Танганьики в июле открыл озеро Бангвеулу (площадь его в зависимости от сезона от 4 до 15 тыс. км²), а за ним — текущую на север через ряд озер р. Луалабу. Он не представлял себе ясно, к какой системе — Нила или Конго — принадлежит эта большая река, и не мог заняться таким сложным вопросом: его самочувствие заметно ухудшилось. Он установил лишь, что могучий поток движется на север, но располагается на высоте около 600 м. Такое низкое гипсометрическое положение Луалабы склоняло его к мысли, что она «в конце концов» может оказаться р. Конго. Повернув обратно к Танганьике, он перешел на лодке с западного берега на восточный, в поселок Уджиджи, и в октябре 1871 г. остановился там для отдыха и лечения.

В Европе и Америке уже несколько лет не знали, где находится Ливингстон и жив ли он.

В Уджиджи и отыскал его Генри Стэнли. Вместе с ним тяжело больной Ливингстон в конце 1871 г. обследовал северный угол Танганьики и убедился, что озеро не имеет стока к северу, следовательно, не является истоком Нила, как раньше предполагали. Он отказался вернуться со Стэнли в Европу, так как хотел закончить исследование Луалабы, мысль о которой не давала ему покоя. Через Стэнли он переслал в Лондон дневники и другие материалы. В 1873 г. он снова отправился к Луалабе и по дороге остановился в поселке Читамбо, к югу от озера Бангвеулу. Утром 1 мая 1873 г. слуги Ливингстона нашли его мертвым в хижине, на полу у койки. Верные товарищи-африканцы перенесли на носилках его забальзамированные останки почти за 1500 км до моря. Из Занзибара его доставили в Лондон и погребли в Вестминстерском аббатстве — усыпальнице королей и выдающихся людей Англии. Его дневники под названием «Последнее путешествие Давида Ливингстона» опубликованы в Лондоне в 1874 г.

Ливингстон постоянно до конца своей жизни вел борьбу с торговлей рабами. Он был убежденным гуманистом, однако и к нему относятся справедливые слова Э. Реклю относительно «носителей христианской культуры» XIX—XX вв.: «…европеец, даже такой, который любит туземцев и умеет заставить их полюбить его, есть в известном смысле их враг; он прокладывает дорогу преемникам менее бескорыстным… даже сам того не желая, он приводит за собой купцов и солдат…»